Samenvatting moleculaire biologische technieken MBT

DNA replicatie (DNA polymerase)


DNA
Reverse transcriptie (RNA polymerase)
Transcriptie
(reverse
transcriptase)
RNA
Translatie (ribosomen)
Eiwit


MBT hoorcollege
PCR

PCR  Vermeerderd een stuk DNA

Waarom PCR? Aanwezigheid van een gen of andere sequentie aantonen
- TEK (kolonie PCR op UVRC gen)
- MBE (kolonie PCR op H2B gen)
- Identificatie van mo
- Identificatie van personen en forensisch onderzoek

Forensische PCR 
Een piek in het DNA profiel (DNA sequentie)  homozygoot
2 pieken in het DNA profiel (DNA sequentie)  heterozygoot

Proces PCR en analyse
- PCR
- Agarose gel electrophoresis
- UV visualisation
- The final product

Promotor, gen of andere genetische onderdelen kloneren

DNA polymerase beweegt over het DNA van 3’  5’
DNA polymerase maakt het DNA van 5’  3’

Doel van PCR  specifiek stuk DNA in vitro te kopiëren (amplificeren)

Proces DNA replicatie

,Waarmee maak je een PCR reactie specifiek? In de DNA replicatie maakt Primase
RNA primers

Verschillen replicatie vs PCR
Replicatie PCR
Helicase Denaturatie (hoge temperatuur 96
graden)
RNA primers Artificiële DNA primers (Oligo’s)
37 graden 72 graden met Taq Polymerase
(bacterie waar het enzym in zit groeit
in gijzers, overleeft hele hoge
temperaturen (werkt het beste bij 72
graden)



PCR benodigdheden
- PCR machine (thermal cycler)
- PCR reactievaatjes
- PCR reactiemengsel
- Analyse systeem; vb agarose gel

PCR reactiemengsel;
- DNA (template)
- Twee primers (forward en reverse)
- Nucleotiden
- Tag polymerase
- Buffer

PCR wat heb je nodig?
- Forward en reverse  startpunt DNA polymerase
- Nucleotiden  bouwstenen DNA
- KCl  monovalent cation (K+) voor optimale binding primers
- Tris  buffer voor optimale pH voor enzym
- MgCl2  divalent cation als cofactor voor enzym
- DNA polymerase  Enzym dat DNA repliceert
- 102 -105 kopiën DNA template  DNA dat geamplificeerd wordt

PCR stappen; 1 PCR cyclus (30-40 keer herhalen)
- Denaturatie (uitsmelten) 90-96 graden  dsDNA wordt ssDNA, 15 s – 30 s
- Annealing (hybridisatie primer) 50-65 graden  primers binden op ssDNA,
15 s – 30 s

, - Extensie (elongatie door polymerase) 72 graden  DNA wordt verdubbeld ,
30 s – 5 min (hoe groter het stuk is dat gekopiërd moet worden, hoe meer
tijd je nodig hebt)
- DNA synthese , 72 graden , 10 min
- 30-40 x herhalen

Na een cycli heb je 2n keer zoveel materiaal (30cycli ; 109 keer zoveel)

Primers ontwerpen

Annealen van primers
- Primers (oligo’s ) korte stukjes enkelstrengs DNA (17-28 nt)
- Synthetisch te maken, opgebouwd uit G, A, T, C
- Elke sequentie te maken
- Specifiek

Stel een primer is gatg (4nt lang)
Om de hoeveel nt kan deze dan specifiek binden?
Dan moeten de 1e, 2e en de 3e en de 4e base passen
De kans hierop is ¼ x ¼ x ¼ x ¼ = (1/4)4 = 1/256
Dus de primer bindt statistisch 1 om de 256 basen
Een DNA fragment van 1000 bp heeft dan ongeveer 4 bindingsplaatsen voor deze
primer (1000/256=4)

Stel een primer is 20 nt lang. Om de hoeveel nt kan deze dan specifiek binden?
De kans hierop is (1/4) 20 – 1/( 1 1012) basen
Dus een primer van 20 nt lang komt in 1 per 1*10 12 basen voor
Humane genoom ; 3*109
Willekeurige primer van 20 nt kan statistisch minder dan 1 keer in het humane
genoom binden

Forward primer, dezelfde sequentie als begin
Reverse primer, reverse complementair

Algemene regels voor primer design
-3’ – end G of C (binding is sterker, 3 waterstofbruggen)
-17-28 bp
-40- 60 % GC
-voorkom primer dimeren (anders bindt forward en reverse primer aan elkaar, ipv
aan template DNA)
-voorkom interne ‘self-annealing)  anders hairpin
-Tm tussen 50 en 70 graden  wanneer 50 % van de primer nog bindt aan target
sequentie
Wordt gemeten door fluorescerend molecuul dat bindt aan enkelstrengs ( of
DS??.. ) DNA

Smelttemperatuur (Tm) = Wanneer 50 % ssDNA en 50% dsDNA is
Smelttemperatuur berekenen;
Tm = 2(A+T) + 4(C+G)

Annealingstemperatuur (Ta) = Tm – 5 graden
Laagste Ta = temperatuur die je in de PCR reactie gebruikt

, Wat kan er gebeuren als er een lagere temperatuur wordt gebruikt bij annealing
 primer wordt aspecifiek, bindt op verkeerde sequentie (Base), kunnen andere
PCR producten ontstaan

Taq DNA polymerase  Thermus aquaticus (optimum synthese temperatuur 72
graden)
-Hitte stabiel
-Geen proofreading activiteit
-1 kb/min

Proofreading  wanneer er een foute base wordt ingebouwd tijdens polymerase,
wordt er dmv hun 3’ 5’ exonuclease activiteit zelf verwijderd dmv polymerases.
Niet alle polymerases hebben proofreading activiteit (bv Taq)

Bronnen template DNA (RNA) (monster)
-klinisch, forensisch, aarde, platen ,fossielen

Template DNA; voorwaarden voor in PCR reacties
-meestal wordt DNA gezuiverd (je weet dan zuiverheid en hoeveelheid)
-Geen remmers van DNA polymerase ( bijvoorbeeld heem groep in hemoglobine,
humuszuur in aarde)
-target bereikbaar voor primers en Taq
-Geen EDTA (of hele lage concentratie; Mg2+
-niet teveel fragmentatie/afbraak
-niet te vaak vriezen/ontdooien

Factoren die degradatie van DNA bevorderen
- Tijd
- Temperatuur
- Vochtigheid
- Licht (UV)
- Blootstelling aan chemicaliën


MBT-hoorcollege Kloneren

Hoe kloneer je een PCR-product? Primers ontwikkelen, primers bevatten extra
sequentie wat niet bindt aan stuk DNA van interesse.

De 5 stappen van het kloneren
- Restrictie-enzymen knippen
- Ligase plakt
- Vectoren

Waarom kloneren? Manipuleren van DNA om eiwit in grote hoeveelheden te
produceren, functie van genen of domeinen van genen te onderzoeken, effect
van gen mutanten bestuderen.

Promotor kloneren  luciferase uit fruitvliegje

5 stappen kloneren:
- Digestie: DNA (plasmide of een PCR-product) met RE knippen
- Ligatie: DNA fragment in het plasmide inbouwen  recombinant
- Transformatie: de plasmiden worden opgenomen door de bacteriën