4 DNA REPLICATIE
4.1 DNA REPPLICATIE IS SEMI-CONSERVATIEF
• 3 mogelijke modellen voor DNA-replicatie:
o B. Semiconservatieve model is het juiste => experiment van Meselson-Stahl
▪ Gebruik van densiteits-centrifugatie met isotopen (zware (+ 1 neutron): stabiel)
▪ Modelsysteem: E. Colibacterie
▪ Stappen
• Ze lieten E. Coli-cellen groeien in een medium met 15N (zware isotoop van
stikstof). 15N is stabiel en niet-radioactief.
• Bacterie verschillende generaties laten groeien in dit medium. Het DNA zal
steeds denser worden, omdat de stikstofhoudende base het 15N inbouwt.
• Bacteriën worden nadien overgebracht naar een ander medium met 14N.
• Densiteit van het bacterieel DNA vergelijken op het einde van de 15N
cultuur en in opeenvolgende relaties bij groei in 14N. Densiteit wordt
bepaald mbv een densiteitsgradiënt centrifugatie + UV-licht.
• Resultaat: DNA na 1 replicatiecyclus in 14N medium heeft een intermediaire
densiteit, in verdere generaties werd de intermediaire band meer en meer
uitverdund. Er is dus sprake van semi-conservatieve structuur.
o => dit alles komt erop neer dat je DNAband telkens zal verdunnen
wanneer je het in een lichter medium brengt en dat je dit kunt
onderzoeken dmv centrifuge en uv-licht
▪ => extra uitleg spraakberichten JADE naar mezelf gestuurd
op 4/4/2024
, 4.2 DNA REPLICATIE GEBEURT MEESTAL BIDIRECTIONEEL
• Waar start replicatie? In een “ori”
o Bekomen via experiment (eenvoudig)
o Restrictie-enzym EcoRI (herkent een specifieke
sequentie, in dit geval 6 nucleotiden)
o Men kende de sequentie van dat eenvoudige virale
chromosoom + men wist dat er maar één plaats was
in dat chromosoom waar die bepaalde
herkenningssequentie voor EcoRI te vinden was
o Men wist dat je het circulair chromosoom kan
lineariseren wnr je het behandelt met EcoRI dus men
deed dat en keek dan met de elektronenmicroscoop
naar waar deze lussen (replicatiebellen) ontstaan
o Men deed dan metingen van de knipplaats tot het
midden van de replicatiebel en dan zag men dat die
afstanden altijd gelijk waren (ongeacht het
replicatiestadium)
o Besluit: dit fenomeen kan enkel wanneer de replicatie
bidirectioneel is
• In chromosomen van eenvoudige organismen, bv. Circulaire chromosomen, was er altijd één ori, maar
in moeilijkere organismen, bv. Mens, in één DNA-fragment meerdere lussen en dus wrs ook meerdere
ori’s
• Wat voor een DNA-sequentie is een ori?
o Bij de E. Coli is dat een sequentie van 240 bp met herhaalde sequenties:
▪ 9-meren (TTATACACA)
▪ 13-meren (GATCTNTTTATTT)
▪ => vooral A’s en T’s => reden? Zie verder uitgelegd
o Bij gisten wat moeilijker: S. cerevisiae: +/- 400 ori’s (met elk 180 bp)
verspreid over 17 chromosomen
o Bij mens: 5000-50’000 ori’s
o A en B zijn uitzonderingen
o C is het normale
o Aantal kenmerken ori’s
▪ Unieke sequenties met herhaalde
subdomeinen
▪ Die herhalingen zijn herkenningsplaatsen
voor eiwitten
▪ Geflankeerd door A/T-rijke gebieden
4.1 DNA REPPLICATIE IS SEMI-CONSERVATIEF
• 3 mogelijke modellen voor DNA-replicatie:
o B. Semiconservatieve model is het juiste => experiment van Meselson-Stahl
▪ Gebruik van densiteits-centrifugatie met isotopen (zware (+ 1 neutron): stabiel)
▪ Modelsysteem: E. Colibacterie
▪ Stappen
• Ze lieten E. Coli-cellen groeien in een medium met 15N (zware isotoop van
stikstof). 15N is stabiel en niet-radioactief.
• Bacterie verschillende generaties laten groeien in dit medium. Het DNA zal
steeds denser worden, omdat de stikstofhoudende base het 15N inbouwt.
• Bacteriën worden nadien overgebracht naar een ander medium met 14N.
• Densiteit van het bacterieel DNA vergelijken op het einde van de 15N
cultuur en in opeenvolgende relaties bij groei in 14N. Densiteit wordt
bepaald mbv een densiteitsgradiënt centrifugatie + UV-licht.
• Resultaat: DNA na 1 replicatiecyclus in 14N medium heeft een intermediaire
densiteit, in verdere generaties werd de intermediaire band meer en meer
uitverdund. Er is dus sprake van semi-conservatieve structuur.
o => dit alles komt erop neer dat je DNAband telkens zal verdunnen
wanneer je het in een lichter medium brengt en dat je dit kunt
onderzoeken dmv centrifuge en uv-licht
▪ => extra uitleg spraakberichten JADE naar mezelf gestuurd
op 4/4/2024
, 4.2 DNA REPLICATIE GEBEURT MEESTAL BIDIRECTIONEEL
• Waar start replicatie? In een “ori”
o Bekomen via experiment (eenvoudig)
o Restrictie-enzym EcoRI (herkent een specifieke
sequentie, in dit geval 6 nucleotiden)
o Men kende de sequentie van dat eenvoudige virale
chromosoom + men wist dat er maar één plaats was
in dat chromosoom waar die bepaalde
herkenningssequentie voor EcoRI te vinden was
o Men wist dat je het circulair chromosoom kan
lineariseren wnr je het behandelt met EcoRI dus men
deed dat en keek dan met de elektronenmicroscoop
naar waar deze lussen (replicatiebellen) ontstaan
o Men deed dan metingen van de knipplaats tot het
midden van de replicatiebel en dan zag men dat die
afstanden altijd gelijk waren (ongeacht het
replicatiestadium)
o Besluit: dit fenomeen kan enkel wanneer de replicatie
bidirectioneel is
• In chromosomen van eenvoudige organismen, bv. Circulaire chromosomen, was er altijd één ori, maar
in moeilijkere organismen, bv. Mens, in één DNA-fragment meerdere lussen en dus wrs ook meerdere
ori’s
• Wat voor een DNA-sequentie is een ori?
o Bij de E. Coli is dat een sequentie van 240 bp met herhaalde sequenties:
▪ 9-meren (TTATACACA)
▪ 13-meren (GATCTNTTTATTT)
▪ => vooral A’s en T’s => reden? Zie verder uitgelegd
o Bij gisten wat moeilijker: S. cerevisiae: +/- 400 ori’s (met elk 180 bp)
verspreid over 17 chromosomen
o Bij mens: 5000-50’000 ori’s
o A en B zijn uitzonderingen
o C is het normale
o Aantal kenmerken ori’s
▪ Unieke sequenties met herhaalde
subdomeinen
▪ Die herhalingen zijn herkenningsplaatsen
voor eiwitten
▪ Geflankeerd door A/T-rijke gebieden
