Samenvatting Weefsels H1: Histologische technieken

Samenvatting histologische
technieken
Inhoud
1. Doel....................................................................................................................................................1
2. Problemen..........................................................................................................................................1
3. Methodes...........................................................................................................................................1
3.1 Fixatie...........................................................................................................................................1
3.2 Inbedden......................................................................................................................................2
3.3 Snijden..........................................................................................................................................2
3.4 Kleuren – lichtmicroscopie............................................................................................................3
3.4.1 Helderheid LM.......................................................................................................................3
3.4.2 Zure en basische kleurstoffen................................................................................................3
3.4.3 Andere kleurtechnieken.........................................................................................................4
3.5 Contrasteren – elektronenmicroscopie.........................................................................................5
3.5.1 Werking..................................................................................................................................5
3.5.2 Observatiemethoden.............................................................................................................5
3.5.3 Speciale observatiemethoden...............................................................................................6

1. Doel
- Weefsels + organen observeerbaar maken voor LM of EM
- LM  kleur
- EM  zwart-wit



2. Problemen
- Weinig contrast in biologisch materiaal  kleur nodig
- Weinig licht( = elektronen) doorlatend  te dik



3. Methodes
3.1 Fixatie
- Bewaren van weefsel met behoud van oorspronkelijke structuur = denatureren van eiwitten =
3D structuur gaat verloren  stilleggen van bacteriële en autolytische afbraakreacties
o Anders zou het weefsel rotten
- Permeabiliseren van celmembraan  gaten in membraan maken zodat kleurstof en
chemische fixatie erin kan
o Soms wordt het membraan daardoor vloeibaar
- Maakt weefsel harder + poreuzer


1

, o Nodig zodat je dunnen coupes kunt snijden
- Soorten fixatie
o Chemische fixatie
 Immersie = onderdompelen
 Perfusie = in bloedvaten spuiten
 Alcoholen
 Ethanol  eiwitten doen neerslaan + ze worden onoplosbaar =
precipiterend fixatief
 Glutaaraldehyde, formaldehyde eiwitten gaan crosslinken=
crosslinkende fixatief  eiwitten zitten aan elkaar vast dus werking
wordt stilgelegd
 Andere: azijnzuur, osmium tetroxide
o Koude fixatie
 Invriezen van weefsel
 Gaat sneller maar minder dunnen coupes
- Artefacten  verandering die tijdens de fixatie ontstaan in een weefsel en dus afwijken van
de in vivo situatie
- Hoe groter het weefsel hoe langer het in het fixatief moet zitten

3.2 Inbedden
- Inbedmiddel
o Substantie die in weefsel dringt
o Moet eerst vloeibaar zijn en dan hard
o Materiaal snijdbaar in dunne coupes
o Bv paraffine/ kaarsvet , hars, plastics
 Verharden door polymerisatie
o Zijn hydrofoob eerst weefsel dehydrateren
 Breng weefsel telkens in ethanol met stapsgewijs met een stijgende
concentratie: 30° 50° 70° 90°
- Clearing
o Gebeurd in tolueen  bindt zowel met ethanol als het inbedmiddel
- Infiltratie  weefsel wordt geplaatst in het vloeibaar inbedmiddel
- Inbedden  verharden van inbedmiddel in weefsel
- Trimmen wegsnijden van inbedmiddel zodat je mooie coupes kunt maken

3.3 Snijden
- Dankzij hardheid van het inbedmiddel kun je het weefsel in dunne coupes snijden
- Microtoom= apparaat waarmee je de coupes kunt snijden
- Paraffine
o 1-20µm 5µm
o Doorlaatbaar voor licht  LM
o Microtoom met stalen mes
- Hars & plastics  harder dan paraffine
o 50 nm – 2µm: half dunne coupes
 LM
 Microtoom met glazen mes
 Meer details
o 60- 100 nm  70 nm

2