Moleculaire genetica
,Inhoudsopgave
1. Genexpressie tools
2. Regulatie genexpressie
3. Regulatie prokaryoten
4. Regulatie eukaryoten
5. Posttranscriptionele regulatie
6. Functie van een gen
, Genexpressie tools – technieken
Herhaling transcriptie
Initiatie → er zijn verschillende eiwitten bij betrokken om de RNA-
polymerase te kunnen laten aankoppelen en te laten starten. Bij
bacteriën is de sigmafactor een initiatiefactor die verantwoordelijk
is voor de specificiteit van de RNA-polymerase, zodat dit aan
promotors kan binden en de juiste genen kan transcriberen.
Verschillende sigmafactoren worden geactiveerd als reactie op
verschillende omstandigheden van het organisme. Ieder RNA-
polymerase molecuul kan met een sigmafactor binden. Naast de
sigmafactor zijn de basale transcriptiefactoren van belang. Samen
met de RNA-polymerase vormen zij het basale
transcriptiecomplex. Aan het einde van de wisselwerkingsacties is
de initiatiefase voltooid en wordt de RNA-polymerase een aantal
malen gefosforyleerd, waardoor het zich kan losmaken van het basale transcriptiecomplex
Elongatie → RNA-synthese kan worden gestart en de RNA-streng groeit in 5' → 3'-richting. Deze fase wordt
elongatie genoemd. Tijdens de elongatie moet telkens het dubbelstrengs-DNA uit elkaar worden gehouden vlak
voor de RNA-polymerase. Dit wordt door een transcriptiefactor bewerkstelligd, namelijk TFIIH (transcriptiefactor
II met helicase activiteit) Vlak na de elongatie wordt aan het 5'-einde van de RNA-synthetiserende streng een
beschermingselement aangebracht, een kap (cap)
Terminatie → elongatie stopt wanneer de
polymerase wederom een specifieke
sequentie tegenkomt. Deze basenvolgorde
wordt polyadenyleringssequentie genoemd
en dient als stopsignaal (basenvolgorde =
'..AATAA..') De laatste fase van de transcriptie
is in werking getreden en wordt terminatie
genoemd. Hier eindigt de transcriptie en het
gesynthetiseerde RNA wordt afgesplitst. Kort
daarop wordt ook de RNA-polymerase
afgekoppeld
, Splicing → een verandering van genetische informatie na transcriptie.
Tijdens de RNA-processing worden de introns uit het pre-mRNA geknipt
en de exons van het pre-mRNA aan elkaar geplakt. Introns komen
hoofdzakelijk voor in eukaryotische cellen. De term splicing is afgeleid
van het splitsen van touwen, waarbij gedeelten van een touw
samengevoegd worden door strengen in elkaar te draaien. Als de introns
uit het pre-mRNA geknipt zijn (dit heet cleavage), blijven enkel de exons
over. Het verbinden van deze exons tot een nieuw geheel, het mRNA,
heet splicing, na de capping (letterlijk kapje opzetten, is het toevoegen
van 7-methylguanosine aan de kop) en polyadenylatie (poly-A-staart op
het einde) is het mRNA klaar om de translatie te ondergaan
Meten van genexpressie op transcriptie niveau
Het meten van genexpressie kan op 2 verschillende manieren: op de manier met PCR of op de manier van
hybridisatie. Maar voordat deze technieken gebruikt kunnen worden, moet er eerst een lysis van de cel gebeuren
of een purificatie van RNA, dit enkel om het t onderzoeken RNA uit de cel te nemen om dit uiteindelijk buiten de
cel om te kunnen onderzoeken
Het eruit nemen van het RNA → de eerste stap om het DNA of RNA te verwijderen is het plaatsen van de cel op
een selectief medium waar het kan groeien zodat er meer exemplaren zijn van het RNA. Uiteindelijk moet de cel
worden gelyseerd zodat het alle componenten vrijgeeft.
• Lyse kan in de vorm voorkomen van chemische, fysische en enzymatische lyse. De fysische lyse omvat
de concepten van het veranderen van de temperatuur, of het toevoegen van vloeibare stikstof, of het
zenden van ulta-sonische stralingen doorheen de cellen, of het door elkaar schudden van de cellen zodat
uiteindelijk het membraan kapot zal gaan en de componenten zo vrijkomen. Dan chemische lyse, dit is
bijvoorbeeld het denatureren van eiwitten, het inhiberen van enzymen of het vormen van een sterke
interactie met de lipiden, dit gebeurt met ionische detergents. Er is ook niet ionische solvents, dit is het
oplossen van bepaalde componenten van de cel in een vloeistof. Er kan ook een gespecialiseerd buffer
worden toegevoegd waarbij de osmotische omgeving sterk zal veranderen waardoor er componenten
uit de cel zullen lekken en uiteindelijk dan leidt tot een lyse
• Fenol chloroform extractie: dit is de tweede stap in het eruit nemen van het gewenste RNA. Dit gebeurt
namelijk door het eruit nemen van het plasmide, dat gebeurt er in deze stap. Door de lyse is het
chromosomaal RNA in stukken gebroken waardoor het nu gemakkelijk weg te spoelen is, omdat het zo
klein is geworden dat het doorheen de filter kan. Het plasmide zal in de lineaire vorm achterblijven in de
filter
• Kolom purificatie: het hebben van 2 verschillende types van purificatie. Het algemene principe erachter
is eerst het uitvoeren van een lyse door middel van een buffer toevoegen. Hierna worden de grote
brokstukken van de cel verwijderd en gebeurt er een homogenisatie van lysaat. De binding van het RNA
wordt nu verhoogt waardoor dit zich nu zal binden aan de kolom. De rest van de componenten kunnen
nu eruit worden gehaald waarna er RNase wordt toegevoegd
o Size-selection chromatography: dit is wanneer een component door de matrix van de kleine
poriën gaat. Deze manier is snel en gemakkelijker dan die met het gebruik van alcohol
o Affinity chromatography: het binden van de macromoleculen aan de resin in de kolom (meestal
zullen ze aan de negatieve kant binden)
,Inhoudsopgave
1. Genexpressie tools
2. Regulatie genexpressie
3. Regulatie prokaryoten
4. Regulatie eukaryoten
5. Posttranscriptionele regulatie
6. Functie van een gen
, Genexpressie tools – technieken
Herhaling transcriptie
Initiatie → er zijn verschillende eiwitten bij betrokken om de RNA-
polymerase te kunnen laten aankoppelen en te laten starten. Bij
bacteriën is de sigmafactor een initiatiefactor die verantwoordelijk
is voor de specificiteit van de RNA-polymerase, zodat dit aan
promotors kan binden en de juiste genen kan transcriberen.
Verschillende sigmafactoren worden geactiveerd als reactie op
verschillende omstandigheden van het organisme. Ieder RNA-
polymerase molecuul kan met een sigmafactor binden. Naast de
sigmafactor zijn de basale transcriptiefactoren van belang. Samen
met de RNA-polymerase vormen zij het basale
transcriptiecomplex. Aan het einde van de wisselwerkingsacties is
de initiatiefase voltooid en wordt de RNA-polymerase een aantal
malen gefosforyleerd, waardoor het zich kan losmaken van het basale transcriptiecomplex
Elongatie → RNA-synthese kan worden gestart en de RNA-streng groeit in 5' → 3'-richting. Deze fase wordt
elongatie genoemd. Tijdens de elongatie moet telkens het dubbelstrengs-DNA uit elkaar worden gehouden vlak
voor de RNA-polymerase. Dit wordt door een transcriptiefactor bewerkstelligd, namelijk TFIIH (transcriptiefactor
II met helicase activiteit) Vlak na de elongatie wordt aan het 5'-einde van de RNA-synthetiserende streng een
beschermingselement aangebracht, een kap (cap)
Terminatie → elongatie stopt wanneer de
polymerase wederom een specifieke
sequentie tegenkomt. Deze basenvolgorde
wordt polyadenyleringssequentie genoemd
en dient als stopsignaal (basenvolgorde =
'..AATAA..') De laatste fase van de transcriptie
is in werking getreden en wordt terminatie
genoemd. Hier eindigt de transcriptie en het
gesynthetiseerde RNA wordt afgesplitst. Kort
daarop wordt ook de RNA-polymerase
afgekoppeld
, Splicing → een verandering van genetische informatie na transcriptie.
Tijdens de RNA-processing worden de introns uit het pre-mRNA geknipt
en de exons van het pre-mRNA aan elkaar geplakt. Introns komen
hoofdzakelijk voor in eukaryotische cellen. De term splicing is afgeleid
van het splitsen van touwen, waarbij gedeelten van een touw
samengevoegd worden door strengen in elkaar te draaien. Als de introns
uit het pre-mRNA geknipt zijn (dit heet cleavage), blijven enkel de exons
over. Het verbinden van deze exons tot een nieuw geheel, het mRNA,
heet splicing, na de capping (letterlijk kapje opzetten, is het toevoegen
van 7-methylguanosine aan de kop) en polyadenylatie (poly-A-staart op
het einde) is het mRNA klaar om de translatie te ondergaan
Meten van genexpressie op transcriptie niveau
Het meten van genexpressie kan op 2 verschillende manieren: op de manier met PCR of op de manier van
hybridisatie. Maar voordat deze technieken gebruikt kunnen worden, moet er eerst een lysis van de cel gebeuren
of een purificatie van RNA, dit enkel om het t onderzoeken RNA uit de cel te nemen om dit uiteindelijk buiten de
cel om te kunnen onderzoeken
Het eruit nemen van het RNA → de eerste stap om het DNA of RNA te verwijderen is het plaatsen van de cel op
een selectief medium waar het kan groeien zodat er meer exemplaren zijn van het RNA. Uiteindelijk moet de cel
worden gelyseerd zodat het alle componenten vrijgeeft.
• Lyse kan in de vorm voorkomen van chemische, fysische en enzymatische lyse. De fysische lyse omvat
de concepten van het veranderen van de temperatuur, of het toevoegen van vloeibare stikstof, of het
zenden van ulta-sonische stralingen doorheen de cellen, of het door elkaar schudden van de cellen zodat
uiteindelijk het membraan kapot zal gaan en de componenten zo vrijkomen. Dan chemische lyse, dit is
bijvoorbeeld het denatureren van eiwitten, het inhiberen van enzymen of het vormen van een sterke
interactie met de lipiden, dit gebeurt met ionische detergents. Er is ook niet ionische solvents, dit is het
oplossen van bepaalde componenten van de cel in een vloeistof. Er kan ook een gespecialiseerd buffer
worden toegevoegd waarbij de osmotische omgeving sterk zal veranderen waardoor er componenten
uit de cel zullen lekken en uiteindelijk dan leidt tot een lyse
• Fenol chloroform extractie: dit is de tweede stap in het eruit nemen van het gewenste RNA. Dit gebeurt
namelijk door het eruit nemen van het plasmide, dat gebeurt er in deze stap. Door de lyse is het
chromosomaal RNA in stukken gebroken waardoor het nu gemakkelijk weg te spoelen is, omdat het zo
klein is geworden dat het doorheen de filter kan. Het plasmide zal in de lineaire vorm achterblijven in de
filter
• Kolom purificatie: het hebben van 2 verschillende types van purificatie. Het algemene principe erachter
is eerst het uitvoeren van een lyse door middel van een buffer toevoegen. Hierna worden de grote
brokstukken van de cel verwijderd en gebeurt er een homogenisatie van lysaat. De binding van het RNA
wordt nu verhoogt waardoor dit zich nu zal binden aan de kolom. De rest van de componenten kunnen
nu eruit worden gehaald waarna er RNase wordt toegevoegd
o Size-selection chromatography: dit is wanneer een component door de matrix van de kleine
poriën gaat. Deze manier is snel en gemakkelijker dan die met het gebruik van alcohol
o Affinity chromatography: het binden van de macromoleculen aan de resin in de kolom (meestal
zullen ze aan de negatieve kant binden)
