METHODEN IN HET BIOMEDISCH ONDERZOEK
1. INLEIDING
BELANG V METHODEN IN BIOMEDISCH ONDERZOEK:
• Dry lab = met computer te werk gaan → goedkoper
• Wet lab = met stoffen en metingen → veel materiaal en minder toegankelijk
DOELSTELLINGEN:
• Overzicht ve aantal belangrijke methoden
→ ethische, wettelijke + veiligheidsaspecten
→ basistechnieken + nieuwe ontwikkelingen
• Chemische, biologische, fysische principes v methoden begrijpen
• Leren strategische keuze te maken voor welbepaalde methoden
→ vergelijken methodes + mogelijkheden/beperkingen
• Inzicht in belang + impact v specifieke biom methoden
• Onderzoeksstrategie opstellen om concrete biom vraag te beantwoorden
→ hoe methodes combineren?
2. BIOMEDISCHE VRAAGSTELLING + ONDERZOEKSMETHODIEK
ZEER BREED GAMMA AAN VRAAGSTELLINGEN:
Fysiologische vraagstellingen <-> pathologische vraagstellingen
Fysiologie Pathologie
Hoe werkt ons lichaam? Wat loopt er fout? Ziekten?
Niveaus:
• Organisme – weefsel – cel – subcellulair (organellen)
Onderzoek:
• Vaak mens / ook modelorganismen (staan model voor bepaalde ziekten bv. muis/fruitvlieg/gistcel/..)
• Soms culturen v menselijke cellen → cellen of weefsel zelf laten verder groeien
• Combi !
Open exploratief <-> hypothese-gedreven
• Open exploratief = onderzoek waarbij breed gezocht wordt naar antwoord zonder specifieke richting
te kiezen + gebruik maken van omnix methode (groot deel onderzoeken bv. volledige genomen)
Bv. Hoe komt het dat sommige mensen zo sterk reageren op COVID?
• Hypothese gedreven = onderzoek waarbij we een antwoord vooropstellen (hypothese) + dit toetsen
Bv. Speelt de vrijzetting v interferonen een bepalende rol bij de reactie op COVID?
,Fundamenteel / translationeel/ klinisch:
• Fundamenteel
→ gericht op gedetailleerde analyse vd moleculaire bestandsdelen + processen in cel/organisme
→ vooral de biologie
• Translationeel
→ maakt overgang tussen fundamenteel + klinisch onderzoek
• Klinisch
→ patiënt-gericht: optimaliseren diagnose + verbeteren behandeling + nieuwe geneesmiddel
→ PICO : patient – intervention – controls – outcome
Analyse in vivo / ex vivo / in vitro / in silico
• In vivo = bepaling bij levende organismen (bv. metingen lichtemp/bloeddruk)
• Ex vivo = metingen op stalen ve organisme (bv. immunohistochemie van biopt)
• In vitro = metingen in proefbuis (bv. kloneren/ celcultuur/..)
• In silicio = analyses met computer (bv. analyse genexpressiedata / studie interactienetwerk)
ONTWERP V BIOMEDISCHE EXPERIMENTEN:
Biomedisch probleem
Literatuur (peer-review)
Testbare onderzoeksvraag/hypothese
Biologisch system (gezond-ziek) / modelsysteem+moduleren
Bepaling vd variabelen (wat meten?)
Keuze van de methoden (hoe?)
Bepaling aantal stalen (power analyse) (technische/ biologische variatie) controles!
Financiering + goedkeuring
Uitvoering experimenten + statische analyse
Herhaling experiment
Conclusie
2 GROTE KLASSEN VAN METHODEN:
Methoden voor analyse : we meten iets Methoden voor modulatie: veranderen iets aan het
organisme/proefmodel
• Klinische analyse (hormonen/.)
• Isolatie, meting, sequentiebepaling DNA • Behandeling met inhibitor
• Analyse processen (gentranscriptie) • Transgenese
• RNA interferentie
,ENKELE DEFINITIES:
Woord Betekenis
Precisie = variabiliteit Maat voor reproduceerbaarheid
→ standaard deviatie / coëfficiënt v variatie
Accuraatheid Verschil tussen gemeten waarde + echte waarde
→ populatiestatistiek
Detectielimiet = gevoeligheid Kleinste waarde die met bepaald gekozen zekerheid
kan gemeten worden
Analytische range / dynamic range Gebied dar reproduceerbare gegeven geeft /
betrouwbaar
Analytische specificiteit = selectiviteit Mate waardoor andere componenten in systeem
interfereren
Analytische sensitivitetit Maat v verandering in output tov in input
Robuustheid Mate waarin methode een consistent resultaat geeft
ondanks kleine verschillen in experimentele
parameters (bv pH)
SELECTIE METHODE:
• Te meten variabele
• Vereiste precisie
• Aantal stalen/waarden
• Beschikbaarheid apparatuur
• Kosten
• Veiligheidsrisco’s
• Vroegere / gepubliceerde ervaringen
• Persoonlijke voorkeur
5. METEN EN SCHATTEN
INLEIDING:
Categorische/ kwalitatieve analyse: Kwantitatieve + vergelijkende analyses:
• Bepalen iets dat discrete waarden geeft • Bepalen iets dat continu kan variëren
• Bv. bepaling gensequentie binnen bereik van waarden
• Bv. identificatie interagerende eiwitten • Bv. cholesterolspiegel / suikerspiegel/ …
Foutenanalyse = noodzakelijk → betrouwbaarheid + onzekerheid over meetresultaten / onderzoek
, MEETONZEKERHEID:
Toevallige fout (meetonzekerheid, precisie) = fout met onvoorspelbare richting + grootte
• Nonchalance/ motivatie vd onderzoeker
• Training/bekwaamheid
0.60 0.63 0.65 0.68 0.70
• Onzekerheid over meetprocedure concentratie (mg/l)
• Omgevingsfactoren
• Statistische aard vh meetproces (concentratie <-> meettijd)
Meetonzekerheid door herhaald uitvoeren ve meting
• N metingen X1 , X2 , .. , Xn
1
• Gemiddelde 𝑋̅ = ∑𝑁 𝑖=1 𝑋𝑖
𝑁
1
• Variantie: 𝑠 = (𝑁−1) ∑𝑁
2 ̅ 2
𝑖=1(𝑋𝑖 − 𝑋 ) → s = standaarddeviatie/afwijking
→ (gemiddelde/mediaan)±(standaardafwijking) eenheid
𝒔
Standaard afwijking (fout) op het gemiddelde: SEM =
√𝑵
• Herhaalde metingen verkleinen meetonzekerheid + verhogen betrouwbaarheid gem
• Metingen herhalen + gem nemen om impact v toevallige fout te verminderen
Praktijk: manuele celtelling
• Mbv telkamer
• Herhaalde telling v cellen in # kwadranten v rooster (onder microscoop) + gem nemen
• Gekende opp + diepte kwadrant → gekend volume → celidensiteit berkenen met formule
• Meer precisie
Relatieve Probabiliteit
Relatieve Probabiliteit
2de is veel beter:
• Grotere onzekerheid bij 1 0.63 0.64 0.65
0.630.66 0.67 0.68 0.64 0.65 0.66 0.67 0.68
concentratie (mg/l) concentratie (mg/l)
→ Verschillen tussen stalen minder snel duidelijk
→ Verschil met vooropgestelde concentratiewaarde ook minder snel duidelijk
SYSTEMATISCHE FOUT:
Systematische fout = herhaalbare fout v dezelfde grootte in dezelfde richting
• Instrumentele fouten
→ beperkte nauwkeurigheid ijking/calibratie (tijd/middelen beperkt)
• Methodologische fouten
→ suboptimaal gebruik v opstelling (verkeerde instellingen)
→opl: meten met 2 of meer onafhankelijke meetopstellingen
• Persoonlijke fouten
→ systematische fouten door operator/ bij voorbereiding vd stalen
→ opl: opbouwen expertise-ervaring
→ validiteit vd meting → GEEN betere nauwkeurigheid mbv gemiddeldes
1. INLEIDING
BELANG V METHODEN IN BIOMEDISCH ONDERZOEK:
• Dry lab = met computer te werk gaan → goedkoper
• Wet lab = met stoffen en metingen → veel materiaal en minder toegankelijk
DOELSTELLINGEN:
• Overzicht ve aantal belangrijke methoden
→ ethische, wettelijke + veiligheidsaspecten
→ basistechnieken + nieuwe ontwikkelingen
• Chemische, biologische, fysische principes v methoden begrijpen
• Leren strategische keuze te maken voor welbepaalde methoden
→ vergelijken methodes + mogelijkheden/beperkingen
• Inzicht in belang + impact v specifieke biom methoden
• Onderzoeksstrategie opstellen om concrete biom vraag te beantwoorden
→ hoe methodes combineren?
2. BIOMEDISCHE VRAAGSTELLING + ONDERZOEKSMETHODIEK
ZEER BREED GAMMA AAN VRAAGSTELLINGEN:
Fysiologische vraagstellingen <-> pathologische vraagstellingen
Fysiologie Pathologie
Hoe werkt ons lichaam? Wat loopt er fout? Ziekten?
Niveaus:
• Organisme – weefsel – cel – subcellulair (organellen)
Onderzoek:
• Vaak mens / ook modelorganismen (staan model voor bepaalde ziekten bv. muis/fruitvlieg/gistcel/..)
• Soms culturen v menselijke cellen → cellen of weefsel zelf laten verder groeien
• Combi !
Open exploratief <-> hypothese-gedreven
• Open exploratief = onderzoek waarbij breed gezocht wordt naar antwoord zonder specifieke richting
te kiezen + gebruik maken van omnix methode (groot deel onderzoeken bv. volledige genomen)
Bv. Hoe komt het dat sommige mensen zo sterk reageren op COVID?
• Hypothese gedreven = onderzoek waarbij we een antwoord vooropstellen (hypothese) + dit toetsen
Bv. Speelt de vrijzetting v interferonen een bepalende rol bij de reactie op COVID?
,Fundamenteel / translationeel/ klinisch:
• Fundamenteel
→ gericht op gedetailleerde analyse vd moleculaire bestandsdelen + processen in cel/organisme
→ vooral de biologie
• Translationeel
→ maakt overgang tussen fundamenteel + klinisch onderzoek
• Klinisch
→ patiënt-gericht: optimaliseren diagnose + verbeteren behandeling + nieuwe geneesmiddel
→ PICO : patient – intervention – controls – outcome
Analyse in vivo / ex vivo / in vitro / in silico
• In vivo = bepaling bij levende organismen (bv. metingen lichtemp/bloeddruk)
• Ex vivo = metingen op stalen ve organisme (bv. immunohistochemie van biopt)
• In vitro = metingen in proefbuis (bv. kloneren/ celcultuur/..)
• In silicio = analyses met computer (bv. analyse genexpressiedata / studie interactienetwerk)
ONTWERP V BIOMEDISCHE EXPERIMENTEN:
Biomedisch probleem
Literatuur (peer-review)
Testbare onderzoeksvraag/hypothese
Biologisch system (gezond-ziek) / modelsysteem+moduleren
Bepaling vd variabelen (wat meten?)
Keuze van de methoden (hoe?)
Bepaling aantal stalen (power analyse) (technische/ biologische variatie) controles!
Financiering + goedkeuring
Uitvoering experimenten + statische analyse
Herhaling experiment
Conclusie
2 GROTE KLASSEN VAN METHODEN:
Methoden voor analyse : we meten iets Methoden voor modulatie: veranderen iets aan het
organisme/proefmodel
• Klinische analyse (hormonen/.)
• Isolatie, meting, sequentiebepaling DNA • Behandeling met inhibitor
• Analyse processen (gentranscriptie) • Transgenese
• RNA interferentie
,ENKELE DEFINITIES:
Woord Betekenis
Precisie = variabiliteit Maat voor reproduceerbaarheid
→ standaard deviatie / coëfficiënt v variatie
Accuraatheid Verschil tussen gemeten waarde + echte waarde
→ populatiestatistiek
Detectielimiet = gevoeligheid Kleinste waarde die met bepaald gekozen zekerheid
kan gemeten worden
Analytische range / dynamic range Gebied dar reproduceerbare gegeven geeft /
betrouwbaar
Analytische specificiteit = selectiviteit Mate waardoor andere componenten in systeem
interfereren
Analytische sensitivitetit Maat v verandering in output tov in input
Robuustheid Mate waarin methode een consistent resultaat geeft
ondanks kleine verschillen in experimentele
parameters (bv pH)
SELECTIE METHODE:
• Te meten variabele
• Vereiste precisie
• Aantal stalen/waarden
• Beschikbaarheid apparatuur
• Kosten
• Veiligheidsrisco’s
• Vroegere / gepubliceerde ervaringen
• Persoonlijke voorkeur
5. METEN EN SCHATTEN
INLEIDING:
Categorische/ kwalitatieve analyse: Kwantitatieve + vergelijkende analyses:
• Bepalen iets dat discrete waarden geeft • Bepalen iets dat continu kan variëren
• Bv. bepaling gensequentie binnen bereik van waarden
• Bv. identificatie interagerende eiwitten • Bv. cholesterolspiegel / suikerspiegel/ …
Foutenanalyse = noodzakelijk → betrouwbaarheid + onzekerheid over meetresultaten / onderzoek
, MEETONZEKERHEID:
Toevallige fout (meetonzekerheid, precisie) = fout met onvoorspelbare richting + grootte
• Nonchalance/ motivatie vd onderzoeker
• Training/bekwaamheid
0.60 0.63 0.65 0.68 0.70
• Onzekerheid over meetprocedure concentratie (mg/l)
• Omgevingsfactoren
• Statistische aard vh meetproces (concentratie <-> meettijd)
Meetonzekerheid door herhaald uitvoeren ve meting
• N metingen X1 , X2 , .. , Xn
1
• Gemiddelde 𝑋̅ = ∑𝑁 𝑖=1 𝑋𝑖
𝑁
1
• Variantie: 𝑠 = (𝑁−1) ∑𝑁
2 ̅ 2
𝑖=1(𝑋𝑖 − 𝑋 ) → s = standaarddeviatie/afwijking
→ (gemiddelde/mediaan)±(standaardafwijking) eenheid
𝒔
Standaard afwijking (fout) op het gemiddelde: SEM =
√𝑵
• Herhaalde metingen verkleinen meetonzekerheid + verhogen betrouwbaarheid gem
• Metingen herhalen + gem nemen om impact v toevallige fout te verminderen
Praktijk: manuele celtelling
• Mbv telkamer
• Herhaalde telling v cellen in # kwadranten v rooster (onder microscoop) + gem nemen
• Gekende opp + diepte kwadrant → gekend volume → celidensiteit berkenen met formule
• Meer precisie
Relatieve Probabiliteit
Relatieve Probabiliteit
2de is veel beter:
• Grotere onzekerheid bij 1 0.63 0.64 0.65
0.630.66 0.67 0.68 0.64 0.65 0.66 0.67 0.68
concentratie (mg/l) concentratie (mg/l)
→ Verschillen tussen stalen minder snel duidelijk
→ Verschil met vooropgestelde concentratiewaarde ook minder snel duidelijk
SYSTEMATISCHE FOUT:
Systematische fout = herhaalbare fout v dezelfde grootte in dezelfde richting
• Instrumentele fouten
→ beperkte nauwkeurigheid ijking/calibratie (tijd/middelen beperkt)
• Methodologische fouten
→ suboptimaal gebruik v opstelling (verkeerde instellingen)
→opl: meten met 2 of meer onafhankelijke meetopstellingen
• Persoonlijke fouten
→ systematische fouten door operator/ bij voorbereiding vd stalen
→ opl: opbouwen expertise-ervaring
→ validiteit vd meting → GEEN betere nauwkeurigheid mbv gemiddeldes
