Moleculaire diagnostiek: deel 1 Basistechnieken DNA
Hoofdstuk 1: Basiskennis moleculaire biologie
1.1. Basisdefinitie vakgebied
Moleculaire biologie
- = wil machinerie en structuur van organismen op moleculair niveau verklaren
- Genetische informatie bekijken
Biotechnologie
- Gebruik van dieren, planten en bacteriën voor wetenschappelijk onderzoek
- DNA/RNA manipulatie
Moleculaire diagnostiek
- Vaststellen van een pathologie via moleculair biologische technieken
1.2. Hoofdtechnieken in de moleculaire diagnostiek
Hybridisatie
= samenkoppelen van 2 elementen
Door middel van probes
Amplificatie
= een bepaald stuk van het DNA gaan vermenigvuldigen
Vormt de basis van PCR; Werkt met primers
Sequentiebepaling (=sequencing)
= de basenvolgorde van nucleotiden in een DNA (of RNA) streng gaan bepalen
EXTRA
We hebben DNA als basis. Op dit DNA
wordt transcriptie gedaan à daar
wordt RNA van afgeschreven. Het
gevormde RNA à bij een eukaryoot:
maturatie; bij prokaryoot:
onmiddellijk klaar voor translatie. Het
RNA wordt dan gebruikt als template
om de aaneenschakeling van de AZ te
gaan bepalen. De aaneengeschakelde
AZ vormen een polypeptide. Na
opvouwing = proteïne.
,Belangrijke slide! à examenvraag!
We hebben DNA in de kern (eukaryoot) of in de cel (prokaryoot). Binnenin dat DNA komt een gen
(=coderende eenheid) voor. Het DNA in zijn geheel kan repliceren naar nieuw DNA. Als een gen
wordt afgeschreven ontstaat er (m)RNA (transcriptie).
(m)RNA zal via translatie worden vertaald tot een polypeptide (aaneenschakeling AZ). Als deze
structuur wordt opgevouwen = proteïne.
Bij prokaryoten gaat deze reactie in één keer door.
Bij eukaryoten zijn er heel veel processen op gang. Met het (m)RNA moet nog vanalles gebeuren
(maturatie) zodanig dat het “klaar” is om vertaald te worden.
• Cap 5’
• Poly A 3’
• Splicing
Bij zowel prokaryoten als eukaryoten is stabiliteit belangrijk. DNA blijft stabiel doorheen het leven
van de cel. Het mRNA dat gevormd word à niet het eeuwige leven in de cel. mRNA dient voor
translatie en wordt terug afgebroken: natuurlijke half-life.
Sommige mRNA’s blijven lang aanwezig: codeert eiwitten voor basisfuncties. Andere verdwijnen
snel: reacties op omstandigheden (bv. koorts, corona,…)
Daarnaast bestaan er ook cel/ziekte-specifieke regulerende RNA (=micro-RNA).
https://www.youtube.com/watch?v=hY_IGPkWh-s
1.5 De uitdrukkingswijze van het genetisch materiaal
DNA ondergaat ook een replicatie proces (een verdubbeling) bij het delen van de cel. De transcriptie
van een gen van DNA naar een RNA transcript vormt verschillende types RNA, waarbij de regulatie
voor het aanmaken, verwerken en stabiliseren van boodschapper of messenger RNA bijzondere
aandacht verdient.
Alle cellen van ons lichaam bevatten hetzelfde DNA en dus de code voor alle eiwitten van ons
lichaam.
,In de buurt van elk gen staat een stukje DNA dat aangeeft welke cel het eiwit in kwestie moet
aanmaken: de promotor.
Een promotor geeft aan
• welke cellen het eiwit in kwestie moeten aanmaken
• op welk moment de cellen dit eiwit moeten aanmaken
• hoeveel van dit eiwit de cellen moeten maken
Het gen is de coderende eenheid van DNA. Eén gen codeert voor minstens 1 eiwit.
Op de tekening zie je ook een promotor = DNA sequentie die de nodige genetische informatie bevat
om de transcriptie op te starten.
Er zijn “actieve” en “stille” promotors.
De actieve promoters werken effectief, de juiste eiwitten zijn gebonden waardoor transcriptie zal
starten. We onderscheiden:
1. Sterk actief: zorgt voor veel transcriptie à veel vorming mRNA à veel vorming van eiwit
2. Zwak actief: weinig transcriptie
1. Constitutief actief: deze is in gelijke mate actief binnen een gelijk celtype, zonder invloed van
buitenaf (omgevingsfactoren, voeding, ziektetoestand,…)
a. Promotoren van structuurelementen, basisenzymen,…
2. Reguleerbaar actief
a. afhankelijk van het celtype zullen andere promotoren actief zijn
b. ontwikkelingsstadium
c. Omgeving, ziektetoestand,… kunnen bepaalde genen meer of minder tot expressie
komen
Bij stille (niet-actieve) promoters à geen transcriptie.
1.5.1. Wat is een gen?
Genen bevatten de codes voor de aanmaak van eiwitten
- Mens bevat 25000 genen in elk van zijn cellen
- Van elk van deze genen heb je een exemplaar van je moeder en een van je vader
, Een gen
- = een DNA-fragment die de nodige genetische informatie bevat voor de vorming van één
specifieke polypeptide
Isovormen
- = verschillende vormen RNA die worden afgeschreven van éénzelfde DNA chromosoomregio
Er zijn verschillende oorzaken van het vormen van isovormen:
- Meerder transcriptie-initiatie startplaatsen
- Meerdere alternatieve splice sites
Roze deel = RNA-coderende sequentie + terminator à vormen het gen. Deze wordt afgeschreven
naar RNA (rood). Hier wordt achteraf een deel aangehecht (geel). Daarnaast zien we de transcriptie
initiatie plaats à hier start de transcriptie: positie +1. Bij de transcriptie terminator plaats stopt de
transcriptie: krijgt een bepaald nummer, naargelang de lengte van de sequentie.
Binnenin het rode deel heb je een eiwit-coderend segment (=open leesraam; ORF). Niet alles wat
wordt afgeschreven, wordt vertaald in eiwit. We hebben zogenaamde 5’UTR en 3’UTR à UTR = un-
translated region: dat gebied wordt niet vertaald. Er wordt enkel vertaald van start tot stop codon.
1.5.2. Genetische overerving
Belangrijke begrippen te kennen:
- Homologe recombinatie
- Cross over
Voor elk gen à 2 kopijen à diploïd
Welk gen wordt er dan overgeschreven als we er 2 hebben? Wie is de baas?
- Vaak komt er maar één tot uiting (deze met het sterkste kenmerk) à dominant
- De andere vorm die niet tot uiting komt = recessief
- Beide genen tot uiting = codominantie
Hoofdstuk 1: Basiskennis moleculaire biologie
1.1. Basisdefinitie vakgebied
Moleculaire biologie
- = wil machinerie en structuur van organismen op moleculair niveau verklaren
- Genetische informatie bekijken
Biotechnologie
- Gebruik van dieren, planten en bacteriën voor wetenschappelijk onderzoek
- DNA/RNA manipulatie
Moleculaire diagnostiek
- Vaststellen van een pathologie via moleculair biologische technieken
1.2. Hoofdtechnieken in de moleculaire diagnostiek
Hybridisatie
= samenkoppelen van 2 elementen
Door middel van probes
Amplificatie
= een bepaald stuk van het DNA gaan vermenigvuldigen
Vormt de basis van PCR; Werkt met primers
Sequentiebepaling (=sequencing)
= de basenvolgorde van nucleotiden in een DNA (of RNA) streng gaan bepalen
EXTRA
We hebben DNA als basis. Op dit DNA
wordt transcriptie gedaan à daar
wordt RNA van afgeschreven. Het
gevormde RNA à bij een eukaryoot:
maturatie; bij prokaryoot:
onmiddellijk klaar voor translatie. Het
RNA wordt dan gebruikt als template
om de aaneenschakeling van de AZ te
gaan bepalen. De aaneengeschakelde
AZ vormen een polypeptide. Na
opvouwing = proteïne.
,Belangrijke slide! à examenvraag!
We hebben DNA in de kern (eukaryoot) of in de cel (prokaryoot). Binnenin dat DNA komt een gen
(=coderende eenheid) voor. Het DNA in zijn geheel kan repliceren naar nieuw DNA. Als een gen
wordt afgeschreven ontstaat er (m)RNA (transcriptie).
(m)RNA zal via translatie worden vertaald tot een polypeptide (aaneenschakeling AZ). Als deze
structuur wordt opgevouwen = proteïne.
Bij prokaryoten gaat deze reactie in één keer door.
Bij eukaryoten zijn er heel veel processen op gang. Met het (m)RNA moet nog vanalles gebeuren
(maturatie) zodanig dat het “klaar” is om vertaald te worden.
• Cap 5’
• Poly A 3’
• Splicing
Bij zowel prokaryoten als eukaryoten is stabiliteit belangrijk. DNA blijft stabiel doorheen het leven
van de cel. Het mRNA dat gevormd word à niet het eeuwige leven in de cel. mRNA dient voor
translatie en wordt terug afgebroken: natuurlijke half-life.
Sommige mRNA’s blijven lang aanwezig: codeert eiwitten voor basisfuncties. Andere verdwijnen
snel: reacties op omstandigheden (bv. koorts, corona,…)
Daarnaast bestaan er ook cel/ziekte-specifieke regulerende RNA (=micro-RNA).
https://www.youtube.com/watch?v=hY_IGPkWh-s
1.5 De uitdrukkingswijze van het genetisch materiaal
DNA ondergaat ook een replicatie proces (een verdubbeling) bij het delen van de cel. De transcriptie
van een gen van DNA naar een RNA transcript vormt verschillende types RNA, waarbij de regulatie
voor het aanmaken, verwerken en stabiliseren van boodschapper of messenger RNA bijzondere
aandacht verdient.
Alle cellen van ons lichaam bevatten hetzelfde DNA en dus de code voor alle eiwitten van ons
lichaam.
,In de buurt van elk gen staat een stukje DNA dat aangeeft welke cel het eiwit in kwestie moet
aanmaken: de promotor.
Een promotor geeft aan
• welke cellen het eiwit in kwestie moeten aanmaken
• op welk moment de cellen dit eiwit moeten aanmaken
• hoeveel van dit eiwit de cellen moeten maken
Het gen is de coderende eenheid van DNA. Eén gen codeert voor minstens 1 eiwit.
Op de tekening zie je ook een promotor = DNA sequentie die de nodige genetische informatie bevat
om de transcriptie op te starten.
Er zijn “actieve” en “stille” promotors.
De actieve promoters werken effectief, de juiste eiwitten zijn gebonden waardoor transcriptie zal
starten. We onderscheiden:
1. Sterk actief: zorgt voor veel transcriptie à veel vorming mRNA à veel vorming van eiwit
2. Zwak actief: weinig transcriptie
1. Constitutief actief: deze is in gelijke mate actief binnen een gelijk celtype, zonder invloed van
buitenaf (omgevingsfactoren, voeding, ziektetoestand,…)
a. Promotoren van structuurelementen, basisenzymen,…
2. Reguleerbaar actief
a. afhankelijk van het celtype zullen andere promotoren actief zijn
b. ontwikkelingsstadium
c. Omgeving, ziektetoestand,… kunnen bepaalde genen meer of minder tot expressie
komen
Bij stille (niet-actieve) promoters à geen transcriptie.
1.5.1. Wat is een gen?
Genen bevatten de codes voor de aanmaak van eiwitten
- Mens bevat 25000 genen in elk van zijn cellen
- Van elk van deze genen heb je een exemplaar van je moeder en een van je vader
, Een gen
- = een DNA-fragment die de nodige genetische informatie bevat voor de vorming van één
specifieke polypeptide
Isovormen
- = verschillende vormen RNA die worden afgeschreven van éénzelfde DNA chromosoomregio
Er zijn verschillende oorzaken van het vormen van isovormen:
- Meerder transcriptie-initiatie startplaatsen
- Meerdere alternatieve splice sites
Roze deel = RNA-coderende sequentie + terminator à vormen het gen. Deze wordt afgeschreven
naar RNA (rood). Hier wordt achteraf een deel aangehecht (geel). Daarnaast zien we de transcriptie
initiatie plaats à hier start de transcriptie: positie +1. Bij de transcriptie terminator plaats stopt de
transcriptie: krijgt een bepaald nummer, naargelang de lengte van de sequentie.
Binnenin het rode deel heb je een eiwit-coderend segment (=open leesraam; ORF). Niet alles wat
wordt afgeschreven, wordt vertaald in eiwit. We hebben zogenaamde 5’UTR en 3’UTR à UTR = un-
translated region: dat gebied wordt niet vertaald. Er wordt enkel vertaald van start tot stop codon.
1.5.2. Genetische overerving
Belangrijke begrippen te kennen:
- Homologe recombinatie
- Cross over
Voor elk gen à 2 kopijen à diploïd
Welk gen wordt er dan overgeschreven als we er 2 hebben? Wie is de baas?
- Vaak komt er maar één tot uiting (deze met het sterkste kenmerk) à dominant
- De andere vorm die niet tot uiting komt = recessief
- Beide genen tot uiting = codominantie
