Samenvatting Inleiding tot biotechnologie en genetica

Inleiding tot biotechnologie en
genetica



H1: Inleiding
 Biologische systemen: micro-organismen, plantaardige of
dierlijke cellen, tevens enzymen geïsoleerd uit levende wezens
o Micro-organismen: bv. schimmels
o Enzymen geïsoleerd uit levende wezens: bv. mRNA vaccins
 Geen klassiek biotechnologisch product: niet aangemaakt in levende cellen
 Het gaat niet over ‘wat is het product’ maar over ‘hoe is het aangemaakt’
o NIET: traditionele agricultuur en veeteelt
 Biotechnologie: gebruik en manipulatie v. biologische systemen
o Bereiding natuurlijke grondstoffen en biomassa
o Het gaat niet over ‘wat is het product’ maar over ‘hoe is het aangemaakt’
 Aanmaak via chemische synthese: chemische risico’s
 Aanmaak via biologische synthese: biologische contaminanten (=stoffen die onbedoeld
ergens terechtkomen)
 Vroeger: onbewust gebruik maken van bacteriën en gisten
o L. Pasteur: micro-organismen zijn verantwoordelijk voor bepaalde omzettingen
o Bv. verkeerde gisten in druiven tijdens productie wijn: omzetting in azijn ipv wijn
 Fermentatie
o Afbraak nr kortere ketens suikers
o Opkoken: micro-organismen die spontaan aanwezig zijn, afdrogen
o Gisten toevoegen, gisten gebruiken suikers en zetten om naar CO 2 en alcohol
 Gisten kunnen max. 12-13% alcohol aan, anders toxisch voor gistcel
 Exponentiële toename v. gisten
 Conc alcohol stijgt, conc gisten daalt (alcohol is afbraakproduct v. gisten)
 DNA manipuleren
o Wijzigingen (in het genoom) v. bepaalde cellen
o Recombinante proteïnen aanmaken op industriële schaal
o Lichaamseigen moleculen in grote hoeveelheden
o Recombinante technieken
 Vaccins, mAb & enzymen
o Gewone biologicals: bv. bloedafgeleide producten
 Deel plasma opgezuiverd om als GM te gebruiken
o Biotechnologische producten: bv. bepaalde antibiotica, bepaalde vaccins
 Aanmaak: micro-organismen manipuleren zonder genetische informatie te wijzigen
o Recombinante producten: bv. insuline
 Menselijke eiwitten produceren + gebruiken als GM

 Insuline
o Aanmaak in zeer beperkt aantal cellen
 Gen dat hiervoor codeert wel aanwezig in alle cellen, maar wordt enkel geproduceerd
door β-cellen in de pancreas
o Genen in genoom worden gestuurd door promotoren
 Af-/aanzetten promotoren door omgevingsfactoren, daardoor zorgen ze ervoor dat
sommige β-cellen wel insuline aanmaken en andere niet
o In het begin geen methionine (=startcodon)

,  Eiwitten onderworpen aan post-translationele modificaties (eiwit synthetiseren en
wijzigen)
 Stuk wegknippen van het eiwit
 Start: signaalsequentie  zorgt ervoor dat eiwit
ergens in het lichaam terechtkomt, wordt er
afgeknipt
o A-keten en B-keten met daartss. een connecting peptide
(posttranslationeel: wegknippen)
 Insuline actief in lichaam: enkel A- en B-keten
 Door disulfidebruggen aan elkaar gehouden
 Interne disulfidebrug
 Analyse biogene producten: belangrijk  kwaliteitscontrole
o Risico op contaminatie
o Analyse eiwitten complexer dan analyse klassieke GM


H2: DNA/RNA
DNA-structuur:
 Primaire structuur = polynucleotide-structuur (oligonucleotide)
o Met 3’-5’-fosfodiëster verbinding tss. nucleotiden
o Suiker-fosfaatskelet met basen gebonden op C 1’ vd. suikermolecule
o Basen bepalen DNA-sequentie
 Secundaire structuur = 2 anti-parallelle ketens
o Watson en Crick model
o Dubbelstrengig
 Enkele virussen enkelstrengig DNA
 Gebieden v. complementariteit met zichzelf
 Interne dubbele helix haarspeld structuren
o 5’  3’
o Ketens samengehouden door H-brug vorming tss. complementaire basen
 A – T (dubbel gebonden)
 G – C (driedubbel gebonden)
 A & G: purines
 C & T: pyrimidines
 Veel genomen: circulaire DNA-moleculen
o Bv. bacteriële genomen, sommige virussen, sommige bacteriofagen & plasmiden
o Plasmiden: los van eigen genoom mee overgeërfd
o Bacteriofagen: fasen in leven waarbij DNA circulair is, fasen in leven waarbij DNA niet
circulair is
o Voor delen: DNA verdubbelen
o Genoom mens: lineair, bij DNA-replicatie en celdelingen een extra probleem
 NIET bij circulair genoom


Denaturatie-Renaturatie
 Denaturatie
o Reversibel proces
o Originele structuur gaat verloren
o H-bruggen worden verbroken (2 strengen laten los)

,  Thermisch: opwarmen & afkoelen
 Onbeperkt herhalen
 pH wijziging: H-brugvorming is afh. vd. pH van het milieu
 pH zuur: DNA-strengen laten los
 pH alkalisch: DNA-strengen komen terug samen
 Te sterk zuur of te sterk alkalisch: DNA breekt af
 Chemische moleculen onderhevig aan afbraakreacties
 Toevoegen additionele stoffen aan buffer
 DNA-strengen destabiliseren door ureum of formamide
 Tm: smelttemperatuur
o Temperatuur waarbij helft vd. basen ongepaard zijn (2 strengen niet volledig los van elkaar)
o Tm stijgt naartmate [G][C] gehalte toeneemt
 A-T: 2 H-bruggen worden gevormd
 G-C: 3 H-bruggen worden gevormd
 Hoe meer G-C bindingen, hoe stabieler de binding, hoe meer E toevoegen om ze uit
elkaar te krijgen, Tm stijgt
o Renaturatie
 Gedenatureerde strengen associëren opnieuw bij 25°C onder Tm
o Volledig denatureren (afbreken, T verhogen)  renaturatie tot Tm (helft basenparen
ongepaard)
 Tm-waarde volgen en meten (want hoeveelheid licht verandert in enkelstrengige vs.
dubbelstrengige configuratie)  zie grafiek
o Spectofotometer
o Cuvet zonder toegevoegde vloeistoffen en absorptie meten bij 260 nm
o Waarde absorptie bij kamerT = 1
o Cuvet geleidelijk aan opwarmen
o Relatieve absorptie blijft 1 (tem. 60°C blijft absorptie hetzelfde als bij kamerT)
o Verder opwarmen: absorptie neemt toe (ongeveer 1,4)
 Basen in dubbelstrengige DNA molecule is in totaliteit iets minder absorberend dan
dezelfde basen in een enkelstrengige DNA molecule (enkel: absorptie stijgt)
o Tm: helft basen enkel., helft basen dubbel. (helft van de curve)
o Verder verwarmen: curve wordt plateau
 Dit voorbeeld: alle DNA is enkel. geworden bij 75-80°C
 Onder 94°C: niet-natuurlijk stuk DNA (poly d(A-T)), bestaat uit dubbel. dat enkel uit A-
en T-basen bestaat, enkel 2 H-bruggen)
 Dit is de zwakste binding die we kunnen hebben
 94°C: volledige denaturatie
 Onder Tm: volledige renaturatie
 Grafiek rechts: correlatie tss Tm en percentage [G][C]
o 0% [G][C]: Tm is ongeveer 70°C
o 50% [G][C]: Tm is ongeveer 90°C
o 100% [G][C]: Tm is >100°C
o 94°C: al het natuurlijk DNA uit levende organismen
is gedenatureerd
o Spectrofotometer: hoeveelheid DNA inschatten
 Absorptie UV-licht
 1 OD260nm = ongeveer 50 µg/ml dubbelstrengig
DNA (Wet Lambert B.) + ongeveer 33 µg/ml
enkelstrengig DNA (schatting)
 Zuiverheid DNA: verhouding OD260/OD280 = 1,8 (bij zuiver DNA)
 OD = optische densiteit

,  Absorptiespectrum: over een range van golflengtes opnemen hvl stof absorbeert bij
desbetreffende golflengtes in grafiek
 Reversibel proces
o 94°C: DNA-strengen komen los van elkaar = denaturatie
o T ver onder Tm: DNA-strengen komen terug bij elkaar = renaturatie
 Renaturatie beïnvloedt door: spelen met T + toevoegen v. kationen
 Hoe hoger conc. v. DNA, hoe sneller renaturatie doorgaat
 Homologe renaturatie
o Met volledig stuk complementair DNA (2 complementaire strengen; geen foutieve basen)
 Conc. DNA hoger  sneller
 Strengen dichter bij elkaar  sneller
o Kationen  verlagen elektrostatische afstoting  renaturatie  hogere Tm
 2 DNA strengen: relatief hoge negatieve lading door fosfaat-suiker skelet
 Fosfaatgroep erop zijn bij fysiologische pH ook negatief geladen
 Kationen zorgen voor neutralisatie elektrostatische afstoting
 Heterologe renaturatie
o Met niet volledig identisch of complementair stuk DNA (fout tijdens renaturatie)
o Tm: -1,4°C/per mismatch (mismatch = fout in complementariteit tss. 2 strengen)
 Indien fout in complementariteit tss. 2 strengen die je samen wilt laten komen
 T waarbij je renatureert moet je lager zetten dan bij homologe renaturatie
 Primers toevoegen (enkelstrengig)  mengen met DNA-staal patiënt (staal dat je wilt testen)
o Stukken renatureren met DNA patiënt door afkoeling tot onder Tm-waarde
o Synthetische stukken: volledig of deels complementair


DNA-replicatie = vermenigvuldigen v. DNA
 Voor celdeling: beide dochtercellen die ontstaan hebben volledig genoom
o Snelheid: 50 nucleotiden/sec.
 Gebeurd op iedere plaats in genoom waar replicatie start
 Genoom: bestaat uit chromosomen  replicatie start tegelijk op beide chromosomen
 Snelheid is dus sneller: 50 nucleotiden/sec. gebeurd op verschillende plaatsen in
genoom + gaat in 2 richtingen
o DNA-basenparing: A-T, G-C
 Complementariteit
o DNA-templating: DNA-strengen gaan uit elkaar tijdens replicatie
 Denaturatie zonder verwarmen, dmv. enzymen
 Beide strengen gebruiken als template
o DNA-polymerase
 3’-5’ richting
 Strengen uit elkaar trekken
 Nieuwe complementaire strengen aanmaken
 Exonuclease activiteit: stukje RNA primer wegknippen + vervangen door DNA-streng
 Thv. Okazaki-fragmenten
o dNTPs = deoxyribonucleotide trifosfaten
 Bouwstenen, voldoende nodig om snelheid v. inbouwen vd. nucleotiden te behouden
o Semi-conservatief
 Nieuwe dubbele streng: nieuwe streng + oude streng
o Replicatievork
 Asymmetrisch
 ‘leading’ streng
 ‘lagging’ streng