Celbiologie en algemene weefselleer
Deel 1: Algemene inleiding
Inleidende begrippen
- Cel = De kleinste georganiseerde eenheid van enige levende structuur die in staat is tot een
meer langdurig onafhankelijk bestaan en vervanging van zijn eigen substantie, mits in een
geschikte omgeving.
- Twee soorten cellen:
▪ Eukaryoten: cellen met nucleus
▪ Prokaryoten: cellen zonder nucleus (bacteriën en algen)
- 4 basisweefsels:
▪ Epitheelweefsel
▪ Bindweefsel
▪ Zenuwweefsel
▪ Spierweefsel
Deel 2: Histologische onderzoekstechnieken
Microscopie – eenheden
- Lengte- eenheid in microscopie:
▪ Micrometer = 0.001 mm = 10−6m -> lichtmicroscopie.
▪ Nanometer = 0.001 m = 10−9 m -> electronenmicroscopie.
▪ 1 Angström = 0.1 nm = 10−10 m -> eenheid die vroeger werd gebruikt.
Oplossend vermogen of resolutie en contrast
Resolutie
- Resolutie of oplossend vermogen (r) = de kleinste afstand tussen twee punten waarbij deze
twee punten nog als twee afzonderlijke punten kunnen gezien worden. Resolutie van ons
oog is 0,2 mm. Resolutie is belangrijker dan de vergroting.
- Interferentie = het proces waarbij 2 of meer golven door combinatie elkaar versterken of
verzwakken, waardoor finaal een golf ontstaat die het resultaat is van combinerende golven.
Het beeld is dus een geheel van inhiberende interferentie van golven, dit fenomeen heet
diffractie.
- Brandpuntafstand/ focale lengte = afstand tussen de lens en het punt waarin de stralen
convergeren na passage doorheen de lens.
- Angulaire apertuur = de helft van de hoek van de lichtkegel die vanuit het specimen
doorheen de objectieflens gaat. Dit is dus een maat voor de hoeveelheid ligt die vanuit het
specimen doorheen de objectieflens gaat.
- De golflengte van het licht (), de resolutie (r), en de brekingsindex (n): de invloed van deze
drie variabelen wordt weergegeven in de vergelijking van Abbé: R=(Kxλ)/NA.
▪ Resolutie moet zo hoog mogelijk zijn, dus r moet een laag getal zijn.
▪ Voor een goede resolutie moet de noemer zo groot mogelijk en teller moet zo laag
mogelijk zijn.
▪ Golflengte van zichtbaar licht bedraagt 400 – 700 nm. Minimale golflengte van 450
nm wordt gebruikt bij een lichtmicroscoop.
1
, ▪ NA is het product van de brekingsindex en de sinus van de angulaire apertuur. De
angulaire apertuur bedraagt 70° waardoor de sin 0.94 wordt. De brekingsindex van
(0.61)(450𝑛𝑚(𝑙𝑖𝑐ℎ𝑡))
lucht is 1.0 -> NA is dus gelijk aan 0.94. r = = 292nm. Het oog heeft
0.94
een resolutie van 0,2 mm -> er is dus
vergroting met factor 1000)
- De constante is altijd 0,61.
- Lambda is de golflengte.
- Hoek alfa kan maximaal 90° zijn.
- N is de brekingsindex (lucht = 1, water = 1,2
en olie 1,4-1,5) -> olie heeft dus de beste NA.
Contrast
- Het kunnen onderscheiden. Weefsels hebben van nature geen contrast. Bij een
lichtmicroscoop kunnen we kleurstof toevoegen of we kunnen een fasecontrastmicroscoop
gebruiken.
De lichtmicroscoop of klaarveld microscoop
- Kan enkel worden gebruikt wanneer specimen voldoende contrast hebben, dit kan door
extra contrast toe te voegen met kleurtechnieken.
- Er moeten dunne coupes gebruikt worden (3-8m).
- Altijd drie lenzen. -> een lens is altijd een lenzencomplex, om abberaties tegen te gaan
(randabberaties, chromatische abberaties,..)
- R = 0.25 m.
- De optische weg:
▪ Start bij een lichtbron, deze stuurt lichtstralen doorheen een condensatorlens.
▪ Condensatorlens: het licht wordt geconcentreerd op het specimen, deze lens zorgt
niet voor een vergrotingsfactor.
▪ Objectieflens: vormt het primaire beeld. De NA van deze lens bepaalt de resolutie en
vergroting van het optisch systeem.
▪ In sommige microscopen een intermediaire lens voor bijkomende vergroting.
▪ Oculairlens: vergroot het beeld. (De totale vergroting = vergrotingsfactor van
objectieflens x vergrotingsfactor oculairlens)
2
,Polarisatiemicroscoop
- Polarisator en analysator zorgen ervoor dat enkel golven in 1 vlak worden doorgelaten.
- Het preparaat zorgt voor de breking.
- Het beeld bestaat uit A en I banden -> je krijgt een dwarsstreping van donkere banden =
aisotroop en bleke banden = isotroop.
! Fasencontrastmicroscoop
- Weefsels zijn van nature contrastarm, levende weefsels kunnen niet gekleurd worden ->
fasecontrastmicroscoop gebruiken.
- Hierdoor wordt het contrast verhoogd zonder het weefsel te kleuren. Dit door variërende
diktes en brekingsindexen te gebruiken in het staal.
- Lichtstralen hebben bij verlaten van lichtbron dezelfde fase, maar wanneer ze een
specimen passeren kan er een faseverschil ontstaan. De microscoop zet het faseverschil om
in een amplitudewijziging waardoor er verschillen in de lichtintensiteit zullen zijn.
- Bij het wijzigen van de lichtstraal:
▪ Breking zorgt voor scherpte
▪ Wijziging in golflengte zorgt voor kleur
▪ Wijziging in amplitude zorgt voor intensiteit
- Bij onderzoek van levende, niet gekleurde species. Veel bij onderzoek met celculturen.
! Fluorescentiemicroscoop
- Werkt op het principe van luminescentie= licht wordt geabsorbeerd door een bepaalde
molecule waarna dit molecule zelf licht uitzendt. Wanneer een atoom een fotonlicht
absorbeert met een bepaalde energetische waarde (= excitatielicht) dan springt 1 van de
elektronen van het atoom naar een baan met een hogere energetische waarde =
geëxciteerde fase. Na een tijdje verliest dit atoom energie en valt terug op oorspronkelijke
baan waarbij het fotonlicht uitzendt = emissielicht.
- Emissielicht bevat minder energie dan excitatielicht.
- Fosforescentie= Wanneer de emissie van licht blijft bestaan na belichting.
- Fluorescentie= Enkel emissie van het licht tijdens de duur van de belichting.
3
, - Photo bleaching= Wanneer de excitatie
te lang duurt kan er uitdoving ontstaan ->
er wordt geen emissielicht meer
uitgezonden.
- Exitatiefilter: laat enkel lichtstralen met
bepaalde golflengte door.
- Condensatorlens: concentreert
exitatielicht op het specimen. Dit zal licht
uitstralen = emissielicht.
- Emissiefilter: houdt excitatielicht tegen
en laat emissielicht door. -> finaal beeld.
- Epifluorescentiemicroscoop:
▪ Lichtbron boven het specimen geplaatst.
▪ Via excitatiefilter en afgebogen dichroïsche spiegel passeert excitatielicht door
objectieflens die dienstdoet als condensatorlens.
▪ Emissielicht, naar alle kanten uitgezonden wordt opgevangen door objectieflens en
passeert door de emissiefilter die strooilicht tegen houdt en enkel emissielicht
doorlaat.
▪ Emissielicht komt terug op de dichroïsche spiegel (-> weerkaatst enkel licht met korte
golflengte en lange golflengte wordt doorgelaten). Dus emissielicht wordt
doorgelaten en via het oculair wordt het finaal beeld gevormd.
- Fluorochromen = moleculen die fluorescerende eigenschappen bezitten.
- Primaire fluorescentie = de fluorescerende eigenschappen zijn reeds in het staal aanwezig
en zorgen zo voor achtergrondfluorescentie. -> bij plantaardig materiaal.
- Secundaire fluorescentie = er zijn geen fluorescerende eigenschappen in de cellen of het
weefsel maar ze bezitten de eigenschap om te binden aan bepaalde cel componenten. Dus
bij het toevoegen van fluorescerende moleculen wordt fluorescentie geïnduceerd in het
weefsel. -> bij dierlijk materiaal.
!De elektronenmicroscoop
- De resolutie is veel beter in vergelijking met de lichtmicroscoop.
- Voorbereiding en instrumentarium is complexer.
- Twee types elektronenmicroscopen:
▪ Tem = transmissie elektronenmicroscoop
▪ Sem = scanning elektronenmicroscoop
4
Deel 1: Algemene inleiding
Inleidende begrippen
- Cel = De kleinste georganiseerde eenheid van enige levende structuur die in staat is tot een
meer langdurig onafhankelijk bestaan en vervanging van zijn eigen substantie, mits in een
geschikte omgeving.
- Twee soorten cellen:
▪ Eukaryoten: cellen met nucleus
▪ Prokaryoten: cellen zonder nucleus (bacteriën en algen)
- 4 basisweefsels:
▪ Epitheelweefsel
▪ Bindweefsel
▪ Zenuwweefsel
▪ Spierweefsel
Deel 2: Histologische onderzoekstechnieken
Microscopie – eenheden
- Lengte- eenheid in microscopie:
▪ Micrometer = 0.001 mm = 10−6m -> lichtmicroscopie.
▪ Nanometer = 0.001 m = 10−9 m -> electronenmicroscopie.
▪ 1 Angström = 0.1 nm = 10−10 m -> eenheid die vroeger werd gebruikt.
Oplossend vermogen of resolutie en contrast
Resolutie
- Resolutie of oplossend vermogen (r) = de kleinste afstand tussen twee punten waarbij deze
twee punten nog als twee afzonderlijke punten kunnen gezien worden. Resolutie van ons
oog is 0,2 mm. Resolutie is belangrijker dan de vergroting.
- Interferentie = het proces waarbij 2 of meer golven door combinatie elkaar versterken of
verzwakken, waardoor finaal een golf ontstaat die het resultaat is van combinerende golven.
Het beeld is dus een geheel van inhiberende interferentie van golven, dit fenomeen heet
diffractie.
- Brandpuntafstand/ focale lengte = afstand tussen de lens en het punt waarin de stralen
convergeren na passage doorheen de lens.
- Angulaire apertuur = de helft van de hoek van de lichtkegel die vanuit het specimen
doorheen de objectieflens gaat. Dit is dus een maat voor de hoeveelheid ligt die vanuit het
specimen doorheen de objectieflens gaat.
- De golflengte van het licht (), de resolutie (r), en de brekingsindex (n): de invloed van deze
drie variabelen wordt weergegeven in de vergelijking van Abbé: R=(Kxλ)/NA.
▪ Resolutie moet zo hoog mogelijk zijn, dus r moet een laag getal zijn.
▪ Voor een goede resolutie moet de noemer zo groot mogelijk en teller moet zo laag
mogelijk zijn.
▪ Golflengte van zichtbaar licht bedraagt 400 – 700 nm. Minimale golflengte van 450
nm wordt gebruikt bij een lichtmicroscoop.
1
, ▪ NA is het product van de brekingsindex en de sinus van de angulaire apertuur. De
angulaire apertuur bedraagt 70° waardoor de sin 0.94 wordt. De brekingsindex van
(0.61)(450𝑛𝑚(𝑙𝑖𝑐ℎ𝑡))
lucht is 1.0 -> NA is dus gelijk aan 0.94. r = = 292nm. Het oog heeft
0.94
een resolutie van 0,2 mm -> er is dus
vergroting met factor 1000)
- De constante is altijd 0,61.
- Lambda is de golflengte.
- Hoek alfa kan maximaal 90° zijn.
- N is de brekingsindex (lucht = 1, water = 1,2
en olie 1,4-1,5) -> olie heeft dus de beste NA.
Contrast
- Het kunnen onderscheiden. Weefsels hebben van nature geen contrast. Bij een
lichtmicroscoop kunnen we kleurstof toevoegen of we kunnen een fasecontrastmicroscoop
gebruiken.
De lichtmicroscoop of klaarveld microscoop
- Kan enkel worden gebruikt wanneer specimen voldoende contrast hebben, dit kan door
extra contrast toe te voegen met kleurtechnieken.
- Er moeten dunne coupes gebruikt worden (3-8m).
- Altijd drie lenzen. -> een lens is altijd een lenzencomplex, om abberaties tegen te gaan
(randabberaties, chromatische abberaties,..)
- R = 0.25 m.
- De optische weg:
▪ Start bij een lichtbron, deze stuurt lichtstralen doorheen een condensatorlens.
▪ Condensatorlens: het licht wordt geconcentreerd op het specimen, deze lens zorgt
niet voor een vergrotingsfactor.
▪ Objectieflens: vormt het primaire beeld. De NA van deze lens bepaalt de resolutie en
vergroting van het optisch systeem.
▪ In sommige microscopen een intermediaire lens voor bijkomende vergroting.
▪ Oculairlens: vergroot het beeld. (De totale vergroting = vergrotingsfactor van
objectieflens x vergrotingsfactor oculairlens)
2
,Polarisatiemicroscoop
- Polarisator en analysator zorgen ervoor dat enkel golven in 1 vlak worden doorgelaten.
- Het preparaat zorgt voor de breking.
- Het beeld bestaat uit A en I banden -> je krijgt een dwarsstreping van donkere banden =
aisotroop en bleke banden = isotroop.
! Fasencontrastmicroscoop
- Weefsels zijn van nature contrastarm, levende weefsels kunnen niet gekleurd worden ->
fasecontrastmicroscoop gebruiken.
- Hierdoor wordt het contrast verhoogd zonder het weefsel te kleuren. Dit door variërende
diktes en brekingsindexen te gebruiken in het staal.
- Lichtstralen hebben bij verlaten van lichtbron dezelfde fase, maar wanneer ze een
specimen passeren kan er een faseverschil ontstaan. De microscoop zet het faseverschil om
in een amplitudewijziging waardoor er verschillen in de lichtintensiteit zullen zijn.
- Bij het wijzigen van de lichtstraal:
▪ Breking zorgt voor scherpte
▪ Wijziging in golflengte zorgt voor kleur
▪ Wijziging in amplitude zorgt voor intensiteit
- Bij onderzoek van levende, niet gekleurde species. Veel bij onderzoek met celculturen.
! Fluorescentiemicroscoop
- Werkt op het principe van luminescentie= licht wordt geabsorbeerd door een bepaalde
molecule waarna dit molecule zelf licht uitzendt. Wanneer een atoom een fotonlicht
absorbeert met een bepaalde energetische waarde (= excitatielicht) dan springt 1 van de
elektronen van het atoom naar een baan met een hogere energetische waarde =
geëxciteerde fase. Na een tijdje verliest dit atoom energie en valt terug op oorspronkelijke
baan waarbij het fotonlicht uitzendt = emissielicht.
- Emissielicht bevat minder energie dan excitatielicht.
- Fosforescentie= Wanneer de emissie van licht blijft bestaan na belichting.
- Fluorescentie= Enkel emissie van het licht tijdens de duur van de belichting.
3
, - Photo bleaching= Wanneer de excitatie
te lang duurt kan er uitdoving ontstaan ->
er wordt geen emissielicht meer
uitgezonden.
- Exitatiefilter: laat enkel lichtstralen met
bepaalde golflengte door.
- Condensatorlens: concentreert
exitatielicht op het specimen. Dit zal licht
uitstralen = emissielicht.
- Emissiefilter: houdt excitatielicht tegen
en laat emissielicht door. -> finaal beeld.
- Epifluorescentiemicroscoop:
▪ Lichtbron boven het specimen geplaatst.
▪ Via excitatiefilter en afgebogen dichroïsche spiegel passeert excitatielicht door
objectieflens die dienstdoet als condensatorlens.
▪ Emissielicht, naar alle kanten uitgezonden wordt opgevangen door objectieflens en
passeert door de emissiefilter die strooilicht tegen houdt en enkel emissielicht
doorlaat.
▪ Emissielicht komt terug op de dichroïsche spiegel (-> weerkaatst enkel licht met korte
golflengte en lange golflengte wordt doorgelaten). Dus emissielicht wordt
doorgelaten en via het oculair wordt het finaal beeld gevormd.
- Fluorochromen = moleculen die fluorescerende eigenschappen bezitten.
- Primaire fluorescentie = de fluorescerende eigenschappen zijn reeds in het staal aanwezig
en zorgen zo voor achtergrondfluorescentie. -> bij plantaardig materiaal.
- Secundaire fluorescentie = er zijn geen fluorescerende eigenschappen in de cellen of het
weefsel maar ze bezitten de eigenschap om te binden aan bepaalde cel componenten. Dus
bij het toevoegen van fluorescerende moleculen wordt fluorescentie geïnduceerd in het
weefsel. -> bij dierlijk materiaal.
!De elektronenmicroscoop
- De resolutie is veel beter in vergelijking met de lichtmicroscoop.
- Voorbereiding en instrumentarium is complexer.
- Twee types elektronenmicroscopen:
▪ Tem = transmissie elektronenmicroscoop
▪ Sem = scanning elektronenmicroscoop
4
