Immunologie course 6 deel 2
Aantekeningen les week 1
Een andere naam voor B7 is CD80-86. Bij praktijk gaan we dit molecuul ook aantonen.
Flowcytometrie. Het gaat over het meten van een stroom van cellen in druppels (meet
(metry) stroom (flow) van cellen (cyto) in druppels). Het gaat in druppels (de druppels gaan
één voor één langs de laser). 30.000-40.000 cellen per seconde kunnen er gemeten worden.
Het meten gebeurt door middel van de lasers te richten op de stroom. Er kunnen twee
dingen worden gemeten, namelijk het licht (FSC vs. SSC) en de fluorescentie. FSC =
forward scater en bepaalt de grootte. SSC = side scater en bepaalt de complexiteit.
Het principe. De vloeistof met cellen wordt opgezogen door de flowtip. Bij deze techniek
wordt gebruik gemaakt van een hydrodynamische focussing. Hydrodynamische focusing is
een techniek, die in de flowcytometrie wordt gebruikt om een betrouwbare meting van
individuele cellen te verkrijgen. Nadat de cellen fluorescent zijn gelabeld moeten ze één voor
één, in een vloeistofstroom, door een laserstraal worden geleid. Om dit te bereiken wordt
gebruikgemaakt van een zogenaamde sheath flow. Dat is een vloeistofstroom, bestaande uit
een buffer zoals PBS, die de vloeistofstroom met cellen geheel omringt. De sheath flow heeft
een hogere snelheid, waardoor de vloeistofstroom met cellen gefocust wordt. Hierdoor
worden de cellen gedwongen één voor één de flow chamber binnen te gaan. Het sample
wordt door de druk van vloeistof door de stroom gevoerd. Dan kunnen ze één voor één
langskomen. De laser is dus gericht op de stromende vloeistof. Eén deelje per keer passeert
de lichtstraal.
Lichtverstrooiing. Hoe werkt dat nou. De laser schiet op de cellen. Er wordt gebruik gemaakt
van detectoren. De basis is dat je kijkt naar hoe groot de cellen zijn en welke richting ze
hebben. Dit meet je met behulp van FSC en SSC.
* FSC (forward schatter). Detector zit achter de lichtstraal en kan de grootte bepalen. Kleine
cel geeft ook een klein signaal.
* SSC (side schatter). Detector in een hoek met de lichtstraal. Hij meet de complexiteit en de
granulariteit. Hoe ingewikkelder hij gevormd is (granulocyt), hoe meer hij afbuigt. Hij meet
dus eigenlijk het licht wat naar de zijkant gaat.
FSC (meet de grootte) SSC (met de granulariteit of complexiteit)
FCS-SSC
grafiek.
Grootte uitgezet tegen de granulariteit. Je krijgt dan
een dot-plot. Naarmate de kleur donkerder wordt,
geeft dat aan dat er meer cellen zitten. Zie afbeelding,
dan kan je zien hoe de granulariteit is en de grootte.
Granulocyten = de bovenste cel (door veel granules).
Lymfocyten = linkse niet gegranuleerd.
Monocyten = rechtse omdat die groter zijn dan de lymfocyten en niet gegranuleerd.
Dode cellen zitten in het hoekje (links in het hoekje). Je kan hierdoor dus bepaalde
celpopulaties onderscheiden.
,Fluorescentie. Elektronen absorberen een foton (licht) van een bepaalde golflengte waar
energie in zit. Elektron absorbeert dus een hoog energetisch foton. Daardoor raken ze in
aangeslagen toestand (excitatie). Elektron wil altijd terugvallen naar lagere staat van energie
(grondtoestand), het uitzenden van deze energie noemen we emissie. Deze heeft een
langere golflengte en een lagere energie dan het aangestraalde licht (het aangestraalde licht
heeft meer energie en een kortere golflengte).
FITC is een molecuul dat qua emissie lijkt op GFP. Het kan zijn dat verschillende labels
eenzelfde exicitatie, maar een verschillend emissie. Bijvoorbeeld dat ze door 488 nm worden
aangestraald maar een andere emissie hebben. Een antilichaam is specifiek voor het
molecuul wat je wilt aantonen. Bindt aan membraan die dat stofje wat je wilt aantonen
hebben en die lichten dan fluorescent op. De niet-gebonden antilichamen wil je wegwassen
(omdat ze anders voor storing kunnen zorgen). Dat zie je ook bij dat plaatje met die grootte,
als er dan een ongebonden antilichaam zal zitten, dan kan dit voor verstoorring zorgen.
Wij hebben een laser van 488 nm en aan de hand van de laser kun je een hele hoop
fluorescente kleuringen gebruiken. Er worden bepaalde filters voor gebruikt. Je straalt het
aan met een bepaalde laser. Met behulp van filters kan je ervoor zorgen dat het licht op een
juiste manier wordt opgevangen. Bij een BP (Band Pass) filter gaat het erom dat er tussen
een bepaald aantal nm hij kan doorlaten. Bij een LP (Long Pass) filter gaat het erom dat hij
boven een bepaald aantal nm kan doorlaten. De detector hoort bij een bepaalde filter.
Je kan met verschillende detectoren en verschillende filters, doorlaten. Bij FSC en SCC
gebruik je BP filter. Voor fluorescentie gebruik je BP en LP.
, Het apparaat.
Voorbeelden
hiervan zijn
FACSCalbur en
CyAn.
Gating strategie
is een populatie
selecteren en dan door analyseren. Binnen een populatie kijken wat voor fluorescentie ze
opvangen. Daarboven is een percentage van welke cellen dat zijn. Dan doe je er een cirkel
omheen en zet je die door naar een volgende grafiek en ga je verder analyseren.
Bijvoorbeeld kan je kijken naar CD3+ cellen. Je zoemt steeds verder in. Dan zoem je dus in
op cellen die hoge fluorescentie hebben bij CD3+. Je weet dan dat het om T cellen gaat.
Daarna zoem je verder in naar hoeveelheid CD4+ en de hoeveelheid CD8+. Dan zie je dat je
duidelijk twee populaties hebt. Je kan dan kijken naar dat percentage. Dan kan je nog verder
gaan, dit is de vierde stap van gating. Bijvoorbeeld CD4+ cellen op zich bekijken dan kijken
naar bijvoorbeeld de hoeveelheid reg-T cellen. Dus eerst kijk je naar aantal lymfocyten. Dan
kijk je naar levend en dood (CD3+). Dan CD4+ en CD8+. Dan CD4+ naar een bepaalde
soort.
Bij levend en door kan je onderscheid maken tussen T cellen en B cellen. B cellen hebben
namelijk geen CD3+.
Een fluorofoor is een fluorecent molecuul. Kanalen zijn de bandbreedte van licht. Kan
verschillende bandbreedtes onderscheiden (deze kanalen worden FL1 tot FL4 genoemd).
Eerste kanaal is het kanaal met de laagste golflengte.
Een fluoroscent molecuul wordt gekoppeld aan een antilichaam. Zo kan je dus zien welke
het is. In vragen is CD3+ gekoppeld aan PE. Dus als hij de kleur van PE aanneemt dan weet
je dat hij positief is voor CD3+. In het voorbeeld is CD4+ gekoppeld aan APC.
Toepassingen flowcytometrie.
* Je kan er cellen mee sorteren (dus cellen fysiek van elkaar onderscheiden). Cellen kunnen
worden gesorteerd aan de hand van een fluorescentiesignaal.
* De grootte en morfologische complexiteit van cellen kan worden bepaald.
* Je kan DNA labelen in cellen en dan meten (onder andere bij de celdeling).
* Er kunnen zowel celoppervlak, intracellulaire en celkern antigenen worden gemeten. Je kan
met alle antilichamen binnen de cel flowcytometrie doen (dus niet alleen aan de buitenkant
van de cel).
* Tevens kan de fosforylering van signaaleiwitten worden gemeten.
* De pH kan bepaald worden binnen in de cel. Bepaalde pH meters die een fluorescent
signaal geven als pH is veranderd.
* De opname van deeltjes/bacteriën door cellen kan worden gemeten.
* Intracellulaire ionen (bijvoorbeeld calcium fluxen) kunnen worden gemeten.
* De vitaliteit van de cel kan worden achterhaald.
, * De cytokine productie van cellen
kan worden gemeten.
* Het meten van de proliferatie van
cellen.
* Het meten van de T-cel receptor
specificiteit.
EN NOG VEEL MEER! Wat kan er
nou niet? Je kan niet de morfologie
van een cel zien, ook kan je niet zien
waar de kleuring zit (dit kan wel met
de microscoop). Het nadeel van de
microscoop is dat je slechts enkele
cellen kan zien.
Aantekeningen les week
2
Flowcytometrie. Antilichamen met
labels (je hebt verschillende labels
met het zelfde excitatie en
verschillend emissie). Hoe kun je
cytokines meten? Dit kan door
middel va ELISA (volgende week in
de theorie) en door middel van
cytokine staining met de
flowcytometer.
* Intracellulaire cytokine staining.
Wat vaak gebeurt is gebruik maken
van de milt van een gevaccineerd
dier. Buiten het lichaam vindt dan de
re-stimulatie met hetzelfde antigeen plaats (ex vivo). Dan vindt er een respons plaats
(cytokine productie). Het is van belang dat de golgistop wordt toegevoegd (wil zeggen dat
alle cytokines die er worden geproduceerd, blijven hangen in de cel). Daarna vindt de
membraankleuring plaats (bijvoorbeeld met anti-CD8). Cellen moeten vervolgens gefixeerd
worden en daarna moet er iets worden toegevoegd dat de cellen permeabel maakt (de
celmembraan wordt dan permeabel, hierdoor kan de kleurstof naar binnen). Als laatste stap
doe je de intercellulaire kleuring die het cytokine kan herkennen (bijvoorbeeld anti-
IFNgamma). Bij de fixatie en de permeabilisatie maak je ruimte voor de antilichamen die je
naderhand toevoegt, antilichamen kunnen dan door de membranen. Hiermee meet je de
intracellulaire cytokines.
Aantekeningen les week 1
Een andere naam voor B7 is CD80-86. Bij praktijk gaan we dit molecuul ook aantonen.
Flowcytometrie. Het gaat over het meten van een stroom van cellen in druppels (meet
(metry) stroom (flow) van cellen (cyto) in druppels). Het gaat in druppels (de druppels gaan
één voor één langs de laser). 30.000-40.000 cellen per seconde kunnen er gemeten worden.
Het meten gebeurt door middel van de lasers te richten op de stroom. Er kunnen twee
dingen worden gemeten, namelijk het licht (FSC vs. SSC) en de fluorescentie. FSC =
forward scater en bepaalt de grootte. SSC = side scater en bepaalt de complexiteit.
Het principe. De vloeistof met cellen wordt opgezogen door de flowtip. Bij deze techniek
wordt gebruik gemaakt van een hydrodynamische focussing. Hydrodynamische focusing is
een techniek, die in de flowcytometrie wordt gebruikt om een betrouwbare meting van
individuele cellen te verkrijgen. Nadat de cellen fluorescent zijn gelabeld moeten ze één voor
één, in een vloeistofstroom, door een laserstraal worden geleid. Om dit te bereiken wordt
gebruikgemaakt van een zogenaamde sheath flow. Dat is een vloeistofstroom, bestaande uit
een buffer zoals PBS, die de vloeistofstroom met cellen geheel omringt. De sheath flow heeft
een hogere snelheid, waardoor de vloeistofstroom met cellen gefocust wordt. Hierdoor
worden de cellen gedwongen één voor één de flow chamber binnen te gaan. Het sample
wordt door de druk van vloeistof door de stroom gevoerd. Dan kunnen ze één voor één
langskomen. De laser is dus gericht op de stromende vloeistof. Eén deelje per keer passeert
de lichtstraal.
Lichtverstrooiing. Hoe werkt dat nou. De laser schiet op de cellen. Er wordt gebruik gemaakt
van detectoren. De basis is dat je kijkt naar hoe groot de cellen zijn en welke richting ze
hebben. Dit meet je met behulp van FSC en SSC.
* FSC (forward schatter). Detector zit achter de lichtstraal en kan de grootte bepalen. Kleine
cel geeft ook een klein signaal.
* SSC (side schatter). Detector in een hoek met de lichtstraal. Hij meet de complexiteit en de
granulariteit. Hoe ingewikkelder hij gevormd is (granulocyt), hoe meer hij afbuigt. Hij meet
dus eigenlijk het licht wat naar de zijkant gaat.
FSC (meet de grootte) SSC (met de granulariteit of complexiteit)
FCS-SSC
grafiek.
Grootte uitgezet tegen de granulariteit. Je krijgt dan
een dot-plot. Naarmate de kleur donkerder wordt,
geeft dat aan dat er meer cellen zitten. Zie afbeelding,
dan kan je zien hoe de granulariteit is en de grootte.
Granulocyten = de bovenste cel (door veel granules).
Lymfocyten = linkse niet gegranuleerd.
Monocyten = rechtse omdat die groter zijn dan de lymfocyten en niet gegranuleerd.
Dode cellen zitten in het hoekje (links in het hoekje). Je kan hierdoor dus bepaalde
celpopulaties onderscheiden.
,Fluorescentie. Elektronen absorberen een foton (licht) van een bepaalde golflengte waar
energie in zit. Elektron absorbeert dus een hoog energetisch foton. Daardoor raken ze in
aangeslagen toestand (excitatie). Elektron wil altijd terugvallen naar lagere staat van energie
(grondtoestand), het uitzenden van deze energie noemen we emissie. Deze heeft een
langere golflengte en een lagere energie dan het aangestraalde licht (het aangestraalde licht
heeft meer energie en een kortere golflengte).
FITC is een molecuul dat qua emissie lijkt op GFP. Het kan zijn dat verschillende labels
eenzelfde exicitatie, maar een verschillend emissie. Bijvoorbeeld dat ze door 488 nm worden
aangestraald maar een andere emissie hebben. Een antilichaam is specifiek voor het
molecuul wat je wilt aantonen. Bindt aan membraan die dat stofje wat je wilt aantonen
hebben en die lichten dan fluorescent op. De niet-gebonden antilichamen wil je wegwassen
(omdat ze anders voor storing kunnen zorgen). Dat zie je ook bij dat plaatje met die grootte,
als er dan een ongebonden antilichaam zal zitten, dan kan dit voor verstoorring zorgen.
Wij hebben een laser van 488 nm en aan de hand van de laser kun je een hele hoop
fluorescente kleuringen gebruiken. Er worden bepaalde filters voor gebruikt. Je straalt het
aan met een bepaalde laser. Met behulp van filters kan je ervoor zorgen dat het licht op een
juiste manier wordt opgevangen. Bij een BP (Band Pass) filter gaat het erom dat er tussen
een bepaald aantal nm hij kan doorlaten. Bij een LP (Long Pass) filter gaat het erom dat hij
boven een bepaald aantal nm kan doorlaten. De detector hoort bij een bepaalde filter.
Je kan met verschillende detectoren en verschillende filters, doorlaten. Bij FSC en SCC
gebruik je BP filter. Voor fluorescentie gebruik je BP en LP.
, Het apparaat.
Voorbeelden
hiervan zijn
FACSCalbur en
CyAn.
Gating strategie
is een populatie
selecteren en dan door analyseren. Binnen een populatie kijken wat voor fluorescentie ze
opvangen. Daarboven is een percentage van welke cellen dat zijn. Dan doe je er een cirkel
omheen en zet je die door naar een volgende grafiek en ga je verder analyseren.
Bijvoorbeeld kan je kijken naar CD3+ cellen. Je zoemt steeds verder in. Dan zoem je dus in
op cellen die hoge fluorescentie hebben bij CD3+. Je weet dan dat het om T cellen gaat.
Daarna zoem je verder in naar hoeveelheid CD4+ en de hoeveelheid CD8+. Dan zie je dat je
duidelijk twee populaties hebt. Je kan dan kijken naar dat percentage. Dan kan je nog verder
gaan, dit is de vierde stap van gating. Bijvoorbeeld CD4+ cellen op zich bekijken dan kijken
naar bijvoorbeeld de hoeveelheid reg-T cellen. Dus eerst kijk je naar aantal lymfocyten. Dan
kijk je naar levend en dood (CD3+). Dan CD4+ en CD8+. Dan CD4+ naar een bepaalde
soort.
Bij levend en door kan je onderscheid maken tussen T cellen en B cellen. B cellen hebben
namelijk geen CD3+.
Een fluorofoor is een fluorecent molecuul. Kanalen zijn de bandbreedte van licht. Kan
verschillende bandbreedtes onderscheiden (deze kanalen worden FL1 tot FL4 genoemd).
Eerste kanaal is het kanaal met de laagste golflengte.
Een fluoroscent molecuul wordt gekoppeld aan een antilichaam. Zo kan je dus zien welke
het is. In vragen is CD3+ gekoppeld aan PE. Dus als hij de kleur van PE aanneemt dan weet
je dat hij positief is voor CD3+. In het voorbeeld is CD4+ gekoppeld aan APC.
Toepassingen flowcytometrie.
* Je kan er cellen mee sorteren (dus cellen fysiek van elkaar onderscheiden). Cellen kunnen
worden gesorteerd aan de hand van een fluorescentiesignaal.
* De grootte en morfologische complexiteit van cellen kan worden bepaald.
* Je kan DNA labelen in cellen en dan meten (onder andere bij de celdeling).
* Er kunnen zowel celoppervlak, intracellulaire en celkern antigenen worden gemeten. Je kan
met alle antilichamen binnen de cel flowcytometrie doen (dus niet alleen aan de buitenkant
van de cel).
* Tevens kan de fosforylering van signaaleiwitten worden gemeten.
* De pH kan bepaald worden binnen in de cel. Bepaalde pH meters die een fluorescent
signaal geven als pH is veranderd.
* De opname van deeltjes/bacteriën door cellen kan worden gemeten.
* Intracellulaire ionen (bijvoorbeeld calcium fluxen) kunnen worden gemeten.
* De vitaliteit van de cel kan worden achterhaald.
, * De cytokine productie van cellen
kan worden gemeten.
* Het meten van de proliferatie van
cellen.
* Het meten van de T-cel receptor
specificiteit.
EN NOG VEEL MEER! Wat kan er
nou niet? Je kan niet de morfologie
van een cel zien, ook kan je niet zien
waar de kleuring zit (dit kan wel met
de microscoop). Het nadeel van de
microscoop is dat je slechts enkele
cellen kan zien.
Aantekeningen les week
2
Flowcytometrie. Antilichamen met
labels (je hebt verschillende labels
met het zelfde excitatie en
verschillend emissie). Hoe kun je
cytokines meten? Dit kan door
middel va ELISA (volgende week in
de theorie) en door middel van
cytokine staining met de
flowcytometer.
* Intracellulaire cytokine staining.
Wat vaak gebeurt is gebruik maken
van de milt van een gevaccineerd
dier. Buiten het lichaam vindt dan de
re-stimulatie met hetzelfde antigeen plaats (ex vivo). Dan vindt er een respons plaats
(cytokine productie). Het is van belang dat de golgistop wordt toegevoegd (wil zeggen dat
alle cytokines die er worden geproduceerd, blijven hangen in de cel). Daarna vindt de
membraankleuring plaats (bijvoorbeeld met anti-CD8). Cellen moeten vervolgens gefixeerd
worden en daarna moet er iets worden toegevoegd dat de cellen permeabel maakt (de
celmembraan wordt dan permeabel, hierdoor kan de kleurstof naar binnen). Als laatste stap
doe je de intercellulaire kleuring die het cytokine kan herkennen (bijvoorbeeld anti-
IFNgamma). Bij de fixatie en de permeabilisatie maak je ruimte voor de antilichamen die je
naderhand toevoegt, antilichamen kunnen dan door de membranen. Hiermee meet je de
intracellulaire cytokines.
