Methoden 3 – samenvatting
H1: inleiding
Methoden 3: van één (enkele) molecule(n) naar omics
- Next Generation sequencing = NGS
Multi-omics:
Bulk- vs single cell-omics
Spatial
omics: ruimtelijke info behouden, cellen bekijken terwijl ze nog in het weefsel zitten
o Fruit bekijken terwijl het nog in de fruitschaal ligt en dus info blijft behouden van
waar in de fruitschaal het zich bevindt.
Interactomics interacties bekijken
Fluxomics meten hoe moleculen worden omgezet in een ander en de snelheden Pathway
analyse.
Gen modulatie: biomedisch probleem bv. ziekte adhv. omics identificatie gen, proteïne, lipide dat
veranderd is in ziekte gen modulatie toepassen om functie van gen/lipide/proteïne in ziekte na te
gaan.
DOEL: Concrete vraagstellingen beantwoorden integratie van methoden.
,H2. DNA
2.1 DNA sequentiebepaling
De novo genoom sequentiebepaling
- Ongekende genomen
- HGP
- Overlappen om zo te achterhalen hoe deze in elkaar passen, repeats zijn een uitdaging!
Resequencing
- Gekende genomen
- Referentiegenoom achterhalen hoe alle fragmenten in elkaar passen door te mappen tov.
referentiegenoom
- Verschillen tussen individuen
o SNP’s
o Ziekten
- Diagnose, farmacogenetica, etc.
Sequentiebepaling als teller
- #DNA moleculen achterhalen
de novo seq. vs reseq.
,2.1.1. 1ste generatie sequentiebepaling
Maxam & Gilbert = chemische klievingsmethode
- Differentiële chemische klieving van nucleïnezuren in 4 verschillende reacties, gevolgd door
scheiding volgens grootte op gel en visualisatie via autoradiografie
- Strengen radioactief merken
Relatief korte fragmenten
Niet helemaal specifiek sequentie niet altijd eenduidig
Fragmenten merken => knippen zodat maar 1 merker per
fragment is.
Dan verschillende klievingsreacties
- Knippen na een G
- Knippen na een G of A
- Knippen na een C of T
- Knippen na een C
Op gel zetten dan adhv. waar bandjes kan je afleiden
welke base zich op die plek bevindt.
ddNTP = ontbreken van 3’ OH,
deze vormt normaal
fosfodiesterverbindingen in een
DNA met
Sanger sequencing = nieuwsynthese keten
dideoxy-keten
terminatie
Template = gefragmenteerd genoom dat geamplificeerd wordt door cloneren of een specifiek
fragment dat geamplificeerd wordt met PCR.
Polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs (elke ddNTP met verschillend fluorescent
label). Reactie gaat gwn door bij inbouw van dNTPs maar stopt bij inbouw van een ddNTP. Daar
fluorescente merker. aflezen in capillaire gelektroforese = elektroferogram, kortse fragment eerst
en zo sequentie bepalen.
- Juiste verhouding dNTPs/ddNTPs
- Betrouwbaarheid verhogen door reactie in beide richtingen uit te voeren FW en RV
primer
Beperkt tot ~500nt, lastig met repeats
€
Phred-Score van elektroferogram:
- 10 = 1/10 bp is fout
- 20 = 1/100 bp is fout
- 30 = 1/1000 bp is fout
Liefst 20 of 30
, Sequentie fout vs mutatie? FW en RV primer ter bevestiging
Craig Venter
Sequentie v.e. individuele mens voor eerste keer. Gedaan adhv. whole genome shotgun
sequencing.
- Random clones, geen mapping
- Sanger
Heel moeilijke data-analyse om alles te assembleren random korte sequenties zonder mapping
reassembleren
Enorme impact op:
- Technologische ontwikkeling van sequencing
- Bio-informatica
- Visie op delen van data open science
- Biologische kennis nagenoeg hele sequentie humane genoom gekend, nu kijkend naar
genetische verschillen en evolutie.
- Etc.
Nieuwe uitdagingen:
- Persoonlijke genoomsequenties van iedereen
Personalized precision medicine
o Sequentie gekend met SNPs diagnose, prognose, preventie, gebruik medicatie,
inzicht in aandoeningen
o THERAPIE OP MAAT
Ethisch!
2.1.2. 2de generatie sequentiebepaling: short-read next-generation
sequencing
DOEL = veel hogere throughput aan veel lagere kost massale DNA sequentiebepaling mogelijk
Parallelle detectie (Massive parallel sequencing)
- Korte sequenties massief parallel sequencen
Miniaturisatie van reacties
Integratie van het proces (pipeline)
- Directe detectie (<> scheiding fragmenten vie gelelectroforese)
4 basis stappen:
- Stap 1: aanmaak DNA library
- Stap 2: Klonale in vitro amplificaties
- Stap 3: Sequencing/sequentiebepaling
- Stap 4: Data analyse
H1: inleiding
Methoden 3: van één (enkele) molecule(n) naar omics
- Next Generation sequencing = NGS
Multi-omics:
Bulk- vs single cell-omics
Spatial
omics: ruimtelijke info behouden, cellen bekijken terwijl ze nog in het weefsel zitten
o Fruit bekijken terwijl het nog in de fruitschaal ligt en dus info blijft behouden van
waar in de fruitschaal het zich bevindt.
Interactomics interacties bekijken
Fluxomics meten hoe moleculen worden omgezet in een ander en de snelheden Pathway
analyse.
Gen modulatie: biomedisch probleem bv. ziekte adhv. omics identificatie gen, proteïne, lipide dat
veranderd is in ziekte gen modulatie toepassen om functie van gen/lipide/proteïne in ziekte na te
gaan.
DOEL: Concrete vraagstellingen beantwoorden integratie van methoden.
,H2. DNA
2.1 DNA sequentiebepaling
De novo genoom sequentiebepaling
- Ongekende genomen
- HGP
- Overlappen om zo te achterhalen hoe deze in elkaar passen, repeats zijn een uitdaging!
Resequencing
- Gekende genomen
- Referentiegenoom achterhalen hoe alle fragmenten in elkaar passen door te mappen tov.
referentiegenoom
- Verschillen tussen individuen
o SNP’s
o Ziekten
- Diagnose, farmacogenetica, etc.
Sequentiebepaling als teller
- #DNA moleculen achterhalen
de novo seq. vs reseq.
,2.1.1. 1ste generatie sequentiebepaling
Maxam & Gilbert = chemische klievingsmethode
- Differentiële chemische klieving van nucleïnezuren in 4 verschillende reacties, gevolgd door
scheiding volgens grootte op gel en visualisatie via autoradiografie
- Strengen radioactief merken
Relatief korte fragmenten
Niet helemaal specifiek sequentie niet altijd eenduidig
Fragmenten merken => knippen zodat maar 1 merker per
fragment is.
Dan verschillende klievingsreacties
- Knippen na een G
- Knippen na een G of A
- Knippen na een C of T
- Knippen na een C
Op gel zetten dan adhv. waar bandjes kan je afleiden
welke base zich op die plek bevindt.
ddNTP = ontbreken van 3’ OH,
deze vormt normaal
fosfodiesterverbindingen in een
DNA met
Sanger sequencing = nieuwsynthese keten
dideoxy-keten
terminatie
Template = gefragmenteerd genoom dat geamplificeerd wordt door cloneren of een specifiek
fragment dat geamplificeerd wordt met PCR.
Polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs (elke ddNTP met verschillend fluorescent
label). Reactie gaat gwn door bij inbouw van dNTPs maar stopt bij inbouw van een ddNTP. Daar
fluorescente merker. aflezen in capillaire gelektroforese = elektroferogram, kortse fragment eerst
en zo sequentie bepalen.
- Juiste verhouding dNTPs/ddNTPs
- Betrouwbaarheid verhogen door reactie in beide richtingen uit te voeren FW en RV
primer
Beperkt tot ~500nt, lastig met repeats
€
Phred-Score van elektroferogram:
- 10 = 1/10 bp is fout
- 20 = 1/100 bp is fout
- 30 = 1/1000 bp is fout
Liefst 20 of 30
, Sequentie fout vs mutatie? FW en RV primer ter bevestiging
Craig Venter
Sequentie v.e. individuele mens voor eerste keer. Gedaan adhv. whole genome shotgun
sequencing.
- Random clones, geen mapping
- Sanger
Heel moeilijke data-analyse om alles te assembleren random korte sequenties zonder mapping
reassembleren
Enorme impact op:
- Technologische ontwikkeling van sequencing
- Bio-informatica
- Visie op delen van data open science
- Biologische kennis nagenoeg hele sequentie humane genoom gekend, nu kijkend naar
genetische verschillen en evolutie.
- Etc.
Nieuwe uitdagingen:
- Persoonlijke genoomsequenties van iedereen
Personalized precision medicine
o Sequentie gekend met SNPs diagnose, prognose, preventie, gebruik medicatie,
inzicht in aandoeningen
o THERAPIE OP MAAT
Ethisch!
2.1.2. 2de generatie sequentiebepaling: short-read next-generation
sequencing
DOEL = veel hogere throughput aan veel lagere kost massale DNA sequentiebepaling mogelijk
Parallelle detectie (Massive parallel sequencing)
- Korte sequenties massief parallel sequencen
Miniaturisatie van reacties
Integratie van het proces (pipeline)
- Directe detectie (<> scheiding fragmenten vie gelelectroforese)
4 basis stappen:
- Stap 1: aanmaak DNA library
- Stap 2: Klonale in vitro amplificaties
- Stap 3: Sequencing/sequentiebepaling
- Stap 4: Data analyse
