Cellulaire biologie: Cellulaire regulatiemechanismen
Deel 1: Transportprocessen in de cel
Sorteren van eiwitten
Eukaryote cel: verschillende organellen transportmechanismen zodat eiwitten in correcte
compartiment terecht komen
Belangrijke componenten om eiwitten te lokaliseren:
- Signaalsequenties aanwezig in eiwitten
- Receptoren die deze signaalsequenties herkennen
- Translocatie door membraan
- Energie die nodig is om het transport door een membraan unidirectioneel te maken
Sorteren naar mitochondriën
Een klein aantal eiwitten van de oxidatieve fosforylatie worden gecodeerd door mitochondriaal DNA
en in de mitochondriën gesynthetiseerd.
1 Structuur en functie:
Dubbel membraan: binnen organel verschillende lokalisaties mogelijk
Buitenste membraan bevat poriën, binnenste membraan is ondoorlaatbaar
Zorgt voor metabole omzettingen (Acetyl-coA ten gevolge van afbraak vetzuren),
stikstofmetabolisme, geprogrammeerde celdood.
2 Eiwitten bestemd voor mitochondriale matrix
Signaalsequentie aan N-terminus bestaande uit 20-50 AZ (hydrofoob, positief geladen basische,
gehydroxyleerde)
Enkel ongevouwen eiwitten geïmporteerd in mitochondriën gebonden aan chaperones
Importsysteem:
- binding van signaalsequentie aan importreceptor in buitenste mit. Membraan (Tom-eiwit)
- receptor brengt eiwit naar importkanaal (Tom40): gelegen op contactplaatsen tussen
binnenste en buitenste membraan
- eiwit getransloceerd door kanaal in binnenste membraan (Tim eiwit)
- N terminale sequentie afgesplitst door protease + eiwit gebonden aan chaperone + eiwit
gevouwen door chaperonine
Hiervoor is energie nodig op 3 plaatsen: binding aan chaperone in cytosol, binding aan chaperone in
mit matrix, generatie van de elektrochemische gradiënt
,3 Eiwitten bestemd voor andere mitochondriale compartimenten
Niet enkel N-terminale sequenties nodig, ook anderen
Import in buitenste membraan mogelijk door eiwit tegen te houden in Tom40 kanaal en lateraal
te laten bewegen
Import in intermembranaire ruimte: eiwit migreert enkel door kanaal van buitenste membraan en
komt vrij
Import in binnenste membraan: eiwit migreert door kanaal in buitenste en binnenste membraan,
eiwit bevat N-terminale EN hydrofobe sequentie (weerhoudt eiwit in binn membraan)
! Pathologie: mutatie in mitochondriaal targeting signaal van DNA-herstel enzym OGG eiwit niet
meer in mitochondriën kanker
Sorteren naar peroxisomen
1 Structuur
Enkelvoudig membraan, in alle eukaryote cellen behalve RBC
Grootte en compositie zijn afhankelijk van celtype
2 functie
Bevatten oxidasen die H2O2 produceren en catalase van H2O2 inactiveert
Belangrijk in lipidenmetabolisme!
3 Transport van eiwitten bestemd voor peroxisomale matrix
1) Synthese op polyribosomen in cytosol
signaalsequenties: PTS1 (C-terminaal + SKL) en PTS2 (N-terminaal)
2) Cytosolische receptoren herkennen ss en brengen eiwit naar peroxisomale membraan
3) Translocatie doorheen membraan + afsplitsing van peroxisomaal matrix eiwit
4) Eiwitten in gevouwen toestand geïmporteerd
5) Eiwitten betrokken = peroxines (Pex)
6) Afhankelijk van ATP
4 Transport van eiwitten bestemd voor peroxisomale membraan
! pathologie: peroxisoom biogenese ziekten
= Zeldzaam + erfelijk veroorzaakt door defect in peroxisomaal importsysteem
- Oorzaak: mutatie van Pex
- Gevolg: peroxisomale eiwitten zijn gelocaliseerd in cytosol waar enzymen niet stabiel zijn
opstapelen van substraten voor peroxisomale B-oxidatie + tekort aan etherfosfolipiden
- Ziektebeeld: Cerebro-hepato-renaal syndroom van Zellweger: hypotonie, dysgenesie van
hersengebieden, niercysten, ..
,Transport naar en van de kern
Nucleaire enveloppe= geperforeerd door talrijke poriën (= nuclear pore complexes die bestaan uit
nucleoporines)
NPC heeft octagonale vorm: 8 filamenten die samengehouden worden door ring (ook nuclear basket
genoemd)
moleculen kleiner dan 60 kDa kunnen diffunderen door NPC
grote moleculen worden getransporteerd met de hulp van eiwitten die ook aan nucleoporines
binden
1 transport van cytosol naar kern
Deze eiwitten worden gesynthetiseerd op polyribosomen + bevatten nuclear localisatie signaal NLS
(meestal basische AZ)
- NLS gebonden aan importin eiwit, complex migreert door NPC door te intrageren met
opeenvolgende nucleoporines
- Importin-cargo complex bindt aan Ran-GTP*
- Affiniteit van importin voor cargo daalt en eiwit komt vrij in nucleoplasma
- Importin-Ran-GTP complex gerecycleerd naar cytosol (GTP GDP door inwerking van Ran-
GAP)
- Ran-GDP teruggebracht naar nucleoplasma waar Ran-GEF het GDP vervangt door GTP dat in
hogere concentraties aanwezig is
*Ran = klein G-proteïne in 2 toestanden: gebonden aan GDP of GTP
2 Transport van de kern naar het cytosol
Gelijkaardig systeem om eiwitten, tRNAs, ribosomen van kern naar cytosol te brengen met behulp
van Nucleaire exportsignalen NES (Leucine-rijke sequentie)
- NES vormt complex met exportin eiwit en Ran-GTP
- Complex diffundeert door nucleaire poriën
- Door werking Ran-GAP (aanwezig aan cytosolische zijde wordt het Ran-GTP gehydroliseed tot
Ran-GDP affiniteit voor exportin eiwit verlaagt: cargo wordt vrijgezet van exportin
- Ran-GDP en exportin worden gerecycleerd naar de nucleus en Ran-GDP Ran-GTP (d.m.v.
Ran-GEF
- mRNPs worden geëxporteerd uit de kern door te binden aan mRNA exporter proteïne
! pathologie: slecht functionerend nucleair import/export systeem: ALS ( amyotrofe lateraal sclerose)
Experimentele procedures om signaalsequenties te identificeren
- Plasmiden die cDNA code voor import van eiwit en receptoreiwit (eiwit waarvan lokalisatie in
de cel makkelijk te bepalen) bevatten vaak GFP (groen fluorescerend)
- In cel: GFP-catalase fusieëiwit aangemaakt. Door C-terminale peroxisomale signaalsequentie
van catalase zal eiwit naar peroxisomen getransloceerd worden (groene stipjes zijn te zien)
MAAR indien er een egale groene fluorescentie ontstaat dan is de sequentie niet volledig
- NOODZAKELIJK: Als bepaalde sequentie niet aanwezig is: eiwit niet op juiste plaats
- VOLDOENDE: bepaald stukje van sequentie is genoeg om eiwit op juiste plaats te krijgen
, De secretorische weg
Alle eiwitten bestemd voor het ER, Golgi, lysosomen, plasmamembraan en voor secretie volgen
dezelfde weg
Oplosbare eiwitten
synthese op vrije polyribosomen in cytosol
Aan N-terminus signaalsequentie die bestaat uit 1 of meerdere positief geladen AZ naast een
continue stretch van 6 tot 12 hydrofobe AZ
Cotranslationeel import
1) Tijdens translatie op cytosolisch ribosoom: signaalsequentie gesynthetiseerd
2) Ss herkend door ‘signaal recognition particle’ (in cytosol) translatie stopt
3) SRP/signaalsequentie/ribosoom complex begeeft zich naar ER membraan: SRP bindt aan SRP
receptor + ribosoom bindt aan een translocatiekanaal in ER membraan
4) SRP wordt afgesplitst, recycleert naar het cytosol en eiwitsynthese gaat verder op RER
5) Tijdens translatie wordt eiwit getransloceerd door kanaal naar het lumen van ER =
cotranslationeel transport
6) Protease dat aanwezig is in het ER membraan en geassocieerd is met het kanaal splitst de
signaalsequentie af
Insertie van eiwitten in membraan
Deze eiwitten worden gesynthetiseerd op RER en worden daar in de membraan geïntegreerd
Tijdens hun verdere weg door de cel blijft de oriëntatie van het eiwit in de membraan behouden!!
Type 1 eiwitten
= bevatten een N-terminale ss en interne hydrofobe sequentie die de membraanspannende a-helix
wordt
1) Cotranslationeel transport gebeurt en als hydrofobe seq in het kanaal komt, stopt de verdere
translocatie
2) Door hydrofobiciteit kan seq lateraal bewegen in fosfolipiden dubbellaag
3) Deze seq = stop transfer anker sequentie (rest van eiwit wordt gesynthetiseerd op RER en
blijft in cytosol
Type 2 en 3 eiwitten
= geen N-terminale ss, wel één interne hydrofobe sequentie die functioneert als een ER ss en als
membraananker sequentie
Type 2:
1) Translatie op vrij ribosoom in cytosol
2) Interne signaalsequentie bindt aan SRP en migreert het complex naar het ER
3) Ss bindt aan translocatiekanaal zodat N-terminus naar cytosol gericht is en de aangroeiende
C-terminus in het lumen getransloceerd wordt
Deel 1: Transportprocessen in de cel
Sorteren van eiwitten
Eukaryote cel: verschillende organellen transportmechanismen zodat eiwitten in correcte
compartiment terecht komen
Belangrijke componenten om eiwitten te lokaliseren:
- Signaalsequenties aanwezig in eiwitten
- Receptoren die deze signaalsequenties herkennen
- Translocatie door membraan
- Energie die nodig is om het transport door een membraan unidirectioneel te maken
Sorteren naar mitochondriën
Een klein aantal eiwitten van de oxidatieve fosforylatie worden gecodeerd door mitochondriaal DNA
en in de mitochondriën gesynthetiseerd.
1 Structuur en functie:
Dubbel membraan: binnen organel verschillende lokalisaties mogelijk
Buitenste membraan bevat poriën, binnenste membraan is ondoorlaatbaar
Zorgt voor metabole omzettingen (Acetyl-coA ten gevolge van afbraak vetzuren),
stikstofmetabolisme, geprogrammeerde celdood.
2 Eiwitten bestemd voor mitochondriale matrix
Signaalsequentie aan N-terminus bestaande uit 20-50 AZ (hydrofoob, positief geladen basische,
gehydroxyleerde)
Enkel ongevouwen eiwitten geïmporteerd in mitochondriën gebonden aan chaperones
Importsysteem:
- binding van signaalsequentie aan importreceptor in buitenste mit. Membraan (Tom-eiwit)
- receptor brengt eiwit naar importkanaal (Tom40): gelegen op contactplaatsen tussen
binnenste en buitenste membraan
- eiwit getransloceerd door kanaal in binnenste membraan (Tim eiwit)
- N terminale sequentie afgesplitst door protease + eiwit gebonden aan chaperone + eiwit
gevouwen door chaperonine
Hiervoor is energie nodig op 3 plaatsen: binding aan chaperone in cytosol, binding aan chaperone in
mit matrix, generatie van de elektrochemische gradiënt
,3 Eiwitten bestemd voor andere mitochondriale compartimenten
Niet enkel N-terminale sequenties nodig, ook anderen
Import in buitenste membraan mogelijk door eiwit tegen te houden in Tom40 kanaal en lateraal
te laten bewegen
Import in intermembranaire ruimte: eiwit migreert enkel door kanaal van buitenste membraan en
komt vrij
Import in binnenste membraan: eiwit migreert door kanaal in buitenste en binnenste membraan,
eiwit bevat N-terminale EN hydrofobe sequentie (weerhoudt eiwit in binn membraan)
! Pathologie: mutatie in mitochondriaal targeting signaal van DNA-herstel enzym OGG eiwit niet
meer in mitochondriën kanker
Sorteren naar peroxisomen
1 Structuur
Enkelvoudig membraan, in alle eukaryote cellen behalve RBC
Grootte en compositie zijn afhankelijk van celtype
2 functie
Bevatten oxidasen die H2O2 produceren en catalase van H2O2 inactiveert
Belangrijk in lipidenmetabolisme!
3 Transport van eiwitten bestemd voor peroxisomale matrix
1) Synthese op polyribosomen in cytosol
signaalsequenties: PTS1 (C-terminaal + SKL) en PTS2 (N-terminaal)
2) Cytosolische receptoren herkennen ss en brengen eiwit naar peroxisomale membraan
3) Translocatie doorheen membraan + afsplitsing van peroxisomaal matrix eiwit
4) Eiwitten in gevouwen toestand geïmporteerd
5) Eiwitten betrokken = peroxines (Pex)
6) Afhankelijk van ATP
4 Transport van eiwitten bestemd voor peroxisomale membraan
! pathologie: peroxisoom biogenese ziekten
= Zeldzaam + erfelijk veroorzaakt door defect in peroxisomaal importsysteem
- Oorzaak: mutatie van Pex
- Gevolg: peroxisomale eiwitten zijn gelocaliseerd in cytosol waar enzymen niet stabiel zijn
opstapelen van substraten voor peroxisomale B-oxidatie + tekort aan etherfosfolipiden
- Ziektebeeld: Cerebro-hepato-renaal syndroom van Zellweger: hypotonie, dysgenesie van
hersengebieden, niercysten, ..
,Transport naar en van de kern
Nucleaire enveloppe= geperforeerd door talrijke poriën (= nuclear pore complexes die bestaan uit
nucleoporines)
NPC heeft octagonale vorm: 8 filamenten die samengehouden worden door ring (ook nuclear basket
genoemd)
moleculen kleiner dan 60 kDa kunnen diffunderen door NPC
grote moleculen worden getransporteerd met de hulp van eiwitten die ook aan nucleoporines
binden
1 transport van cytosol naar kern
Deze eiwitten worden gesynthetiseerd op polyribosomen + bevatten nuclear localisatie signaal NLS
(meestal basische AZ)
- NLS gebonden aan importin eiwit, complex migreert door NPC door te intrageren met
opeenvolgende nucleoporines
- Importin-cargo complex bindt aan Ran-GTP*
- Affiniteit van importin voor cargo daalt en eiwit komt vrij in nucleoplasma
- Importin-Ran-GTP complex gerecycleerd naar cytosol (GTP GDP door inwerking van Ran-
GAP)
- Ran-GDP teruggebracht naar nucleoplasma waar Ran-GEF het GDP vervangt door GTP dat in
hogere concentraties aanwezig is
*Ran = klein G-proteïne in 2 toestanden: gebonden aan GDP of GTP
2 Transport van de kern naar het cytosol
Gelijkaardig systeem om eiwitten, tRNAs, ribosomen van kern naar cytosol te brengen met behulp
van Nucleaire exportsignalen NES (Leucine-rijke sequentie)
- NES vormt complex met exportin eiwit en Ran-GTP
- Complex diffundeert door nucleaire poriën
- Door werking Ran-GAP (aanwezig aan cytosolische zijde wordt het Ran-GTP gehydroliseed tot
Ran-GDP affiniteit voor exportin eiwit verlaagt: cargo wordt vrijgezet van exportin
- Ran-GDP en exportin worden gerecycleerd naar de nucleus en Ran-GDP Ran-GTP (d.m.v.
Ran-GEF
- mRNPs worden geëxporteerd uit de kern door te binden aan mRNA exporter proteïne
! pathologie: slecht functionerend nucleair import/export systeem: ALS ( amyotrofe lateraal sclerose)
Experimentele procedures om signaalsequenties te identificeren
- Plasmiden die cDNA code voor import van eiwit en receptoreiwit (eiwit waarvan lokalisatie in
de cel makkelijk te bepalen) bevatten vaak GFP (groen fluorescerend)
- In cel: GFP-catalase fusieëiwit aangemaakt. Door C-terminale peroxisomale signaalsequentie
van catalase zal eiwit naar peroxisomen getransloceerd worden (groene stipjes zijn te zien)
MAAR indien er een egale groene fluorescentie ontstaat dan is de sequentie niet volledig
- NOODZAKELIJK: Als bepaalde sequentie niet aanwezig is: eiwit niet op juiste plaats
- VOLDOENDE: bepaald stukje van sequentie is genoeg om eiwit op juiste plaats te krijgen
, De secretorische weg
Alle eiwitten bestemd voor het ER, Golgi, lysosomen, plasmamembraan en voor secretie volgen
dezelfde weg
Oplosbare eiwitten
synthese op vrije polyribosomen in cytosol
Aan N-terminus signaalsequentie die bestaat uit 1 of meerdere positief geladen AZ naast een
continue stretch van 6 tot 12 hydrofobe AZ
Cotranslationeel import
1) Tijdens translatie op cytosolisch ribosoom: signaalsequentie gesynthetiseerd
2) Ss herkend door ‘signaal recognition particle’ (in cytosol) translatie stopt
3) SRP/signaalsequentie/ribosoom complex begeeft zich naar ER membraan: SRP bindt aan SRP
receptor + ribosoom bindt aan een translocatiekanaal in ER membraan
4) SRP wordt afgesplitst, recycleert naar het cytosol en eiwitsynthese gaat verder op RER
5) Tijdens translatie wordt eiwit getransloceerd door kanaal naar het lumen van ER =
cotranslationeel transport
6) Protease dat aanwezig is in het ER membraan en geassocieerd is met het kanaal splitst de
signaalsequentie af
Insertie van eiwitten in membraan
Deze eiwitten worden gesynthetiseerd op RER en worden daar in de membraan geïntegreerd
Tijdens hun verdere weg door de cel blijft de oriëntatie van het eiwit in de membraan behouden!!
Type 1 eiwitten
= bevatten een N-terminale ss en interne hydrofobe sequentie die de membraanspannende a-helix
wordt
1) Cotranslationeel transport gebeurt en als hydrofobe seq in het kanaal komt, stopt de verdere
translocatie
2) Door hydrofobiciteit kan seq lateraal bewegen in fosfolipiden dubbellaag
3) Deze seq = stop transfer anker sequentie (rest van eiwit wordt gesynthetiseerd op RER en
blijft in cytosol
Type 2 en 3 eiwitten
= geen N-terminale ss, wel één interne hydrofobe sequentie die functioneert als een ER ss en als
membraananker sequentie
Type 2:
1) Translatie op vrij ribosoom in cytosol
2) Interne signaalsequentie bindt aan SRP en migreert het complex naar het ER
3) Ss bindt aan translocatiekanaal zodat N-terminus naar cytosol gericht is en de aangroeiende
C-terminus in het lumen getransloceerd wordt
