Celcultuur
Hoofdstuk 1: inleiding
1. Geschiedenis
Oorsprong 1907: Ross Harrison heeft voor het eerst weefsel in leven proberen te
houden op een labotafel. Dit deed hij door kikkerweefsel isoleren (incubatoren
waren er namelijk nog niet in die tijd). Waarom een kikker? Omdat een kikker
koudbloedig is en dat is makkelijk te bewaren op kamertemperatuur weefsel
van de mens moet op 37 graden gehouden worden in incubatoren.
Er waren wel wat problemen
Lucht is niet steriel maar met antibiotica kan het misschien wel (eerste
antibioticum: penicilline)
Weefsel samen bloed, maar bloed is niet het ideale medium Rond 1950
was er een kanteling in de wetenschap, dus werd er gewerkt met
chemisch gedefinieerde cultuurmedia. Dit had als voordeel dat het medium
hetzelfde bleef. Niet alleen het weefsel groeide, maar ook microbacteriën.
Cellen groeien veel trager dan bacteriën, dus de bacteriën gaan de
voedingstoffen meepakken en gaan suikers omzetten tot melkzuur.
Hierdoor gaat de pH dalen en gaat de cellen kapot. Een middel om dit te
vermijden is antibiotica, maar dat was er in die niet tijd. Dit geneesmiddel
maakt het mogelijk dat cellen gaan groeien zonder micro-organismen. Met
de ontwikkeling van antibiotica kreeg celcultuur een boost.
Van cellen naar weefsel gaan, moet je cellen losmaken. Dit kun je doen door
trypsine (een enzym) toevoegen. Trypsine is een proteoase dat een eiwit gaat
splitsen. Door trypsine krijgen we cellen die los zijn, door antibiotica krijgen we
cellen zonder micro-organisme (steriele cellen) en dan gaan de cellen groeien
door chemisch gedefinieerde cultuurmedia (water + voedingsstoffen, zoals
glucose, vitamines, etc.).
Chemisch gedefinieerde cultuurmedia: we vertrekken van water en we voegen
alle bestanddelen nodig die de cel nodig heeft om te groeien, zoals eiwitten,
suikers… en chemisch gedefinieerd betekent dat je weet hoeveel je precies moet
toevoegen
Polio virus = kinderverlamming
Polio is een naakt virus & een RNA virus
Micro-organismen: bacteriën, parasieten, fungi, virussen. Virussen zijn
obligatoir intracellulair, m.a.w. die hebben cellen (= een gastheer) nodig
om te groeien. We hebben twee soorten cellen; naakt en envelop. Een
virusdeeltje bestaat uit een nucleuscapside (genetisch materiaal van de
vrius beschermen) met daarin DNA en RNA. Bij het naaktvirus staan op die
nucleuscapside glycoproteïnen op (spikes) waarmee het vast kan hechten
op de receptor van de cel en zo kan binnendringen. Een voorbeeld van een
naakt virus is polio. Een envelop virus heeft rond de nucleuscapside nog
eens een envelop waarop spikes staan waarmee het zich kan vasthechten.
, Polio virus gaat zich hechten op de receptor van de cel en dit gaat het
virus doen aan de hand van de spike die hij zelf heeft
Rond WOII was er een pandemie van het polio virus. Polio kan leiden tot
verlamming (asymmetrisch). Rond de jaren 50 kwam de celcultuur op door die 3
aspecten. In 1949 kon me een virus uit cellen kweken, in dit geval polio.
Het polio virus kon gegroeid worden in cellen. in 1953 en 1957 zijn er twee
vaccins gekomen (door middel van een verschillende bereiding van het vaccin).
Optie 1: polio inactief maken
- dood virusdeeltje maken adhv formaldehyde (wordt gebruikt om
preparaten te behouden)
- structuur gaat door die formaldehyde behouden kunnen worden,
maar het organisme gaat toch dood
- Eiwitten gaan niet meer kunnen functioneren, dus idem voor de
enzymes
- Voor vaccins moet de buitenste structuur behouden blijven (zie foto
hierboven)
Levend verzwakt polio vaccin
- We gaan het zo maken dat het virus enkel kan groeien in de
celcultuur maar niet bij de mens we gaan dat virusdeeltje dat bij
de mens goed kan groeien, gaan we in het labo laten kweken, maar
we gaan maken dat het minder goed gaat groeien bij de mens maar
wel goed in het labo.
- Cellen gaan zich in de fles vasthechten en daarboven doe je medium
(= cultuurmedium) monolaag 1 laag op het oppervlak dat niet
gaat groeien. Virusdeeltje komt in de cel. Als 1 virusdeeltje
binnenkomt, komen er 100-en vrij die de anderen gaan infecteren
dus krijg je een virusfabriek.
- Bij deze techniek worden de virusdeeltjes gecollecteerd, worden die
in een nieuwe fles gebracht met opnieuw cellen en dan krijg je terug
hetzelfde. Als je dat blijft doen, gaan die enkel nog maar kunnen
groeien in het medium met deze opstelling.
- Virussen die heel verzwakt zijn en dus geen mens of dier meer
kwaad kunnen doen, nemen we dan en gebruiken we als vaccin
levend verzwakt vaccin
,HELA cells
Vernoemd naar Henriette Lacks. Ze had baarmoederhalskanker
(veroorzaakt door het humaan papillon virus). Ze is daaraan overleden in
het jaar ’51, maar men heeft haar kankercellen bijgehouden. Dit is één
van de cellijnen die het eerst gebruikt werden in labo’s.
Veelvuldig gebruikt bij kankeronderzoek
Hybridoma-technologie
1975: Köhler en Milstein
Technologie om monoklonale antilichamen te
produceren (belangrijk in de farmacie)
- Muis infecteren met antigen
- B-cellen komen vrij.
- We gaan bij dat dier de B-cellen isoleren
(de milt wordt er dus eerst uitgehaald en
daarna vindt de isolatie plaats).
- B-cellen maken antilichamen aan
Probleem als je die cellen 10-tal jaren wilt gebruiken om
antilichamen te produceren? Die B-cellen gaan op een
bepaalde afsterven
- We gaan een continu cel maken die de antilichamen kan blijven
aanmaken (= dat is een tumor dat kan blijven groeien)
- PEG (= poly-ethyleen glycol) is een stof die zorgt dat die tumorale
cellen met die B-cellen kunnen fuseren hybridoma’s
- Die hybridoma’s worden dan samen in een petrischaaltje gebracht
met andere antigenen na wegwassen blijven enkel de gebonden
antilichamen hangen monoclonale antilichamen (1 enkele soort
antilichaam geïsoleerd)
- Wanneer je de juiste cellen hebt, kun je die laten groeien
Cel- en weefseltechnologie
Implantaten
Skingrafting: brandwonden, diabetesvoet
- Diabetes wonden gaan niet zoals bij normale mensen genezen,
waardoor er misschien iets moet worden geamputeerd (bv. een
zwarte teen)
- Diabetes patiënt probleem met insuline. Insuline in pancreas aan
gemaakt (eilandjes van Langerhans). Bij transplantatie 80% cellen
weg, geen oplossing.
- Oplossing: Cellen van Langerhans aanmaken en binnenbrengen in
patiënt met scaffle. Aanbrengen aan bloedbaan.
- Rode kleur: pH-indicator (rood: pH=neutraal)
- Ook belangrijk voor verminderen van infectie gevaar
- Weefsel: verschillende soorten cellen
- Weefsel kapotmaken met trypsine aparte cellen
, - Cellen moeten we gaan kweken in een cultuurfles (onderaan: substraat
= oppervlak waar we cellen aan kunnen vasthechten) met daarboven:
cultuurmedium
- Cellen groeien tot monolaag
Als je die cellen gewoon een week laat staan, komen die
cellen los en gaan ze dood
- Juist voor de monolaag er is, moet je trypsine toevoegen
- Subcultivatie/Passage, waarbij je cellen in een nieuwe cultuurfles gaat
brengen gaat terug naar de eerste stap waar we cellen kweken
2. Voordelen
Controle van de omgeving
Fysicochemische parameters: pH, temp, osm druk, O2 en CO2
- Ph = neutraal (7,2) bacteriën hebben een veel groter bereik dan
cellen (komen zowel voor bij Ph 8 als zelfs Ph 6)
- Temperatuur in incubatoren: 35-37°C
- Osmotische druk: isotoon (0,9% Na)
- 21% O2 en 0,03% CO2 (CO2 bicarbonaat buffer andere
percentage)
Fysiologische parameters: voedingsstoffen (+ % serum)
Karakterisatie en homogeniteit
Redelijk homogeen: 1 type cellen, maar normale cellen verouderen. Dan is
het belangrijk om een cryostock aan te maken.
- Stel we maken een klein bioptje (fibroblasten) in een medium. Dit
brengen we dan in een cultuurfles. Na een week heb je een
monolaag in je cultuurfles. Dan moet je actie ondernemen en dat
noemt men subcultiseren = passeren = overbrengen van 1
cultuurfles naar een andere cultuurfles, want anders gaan de cellen
dood. Je moet bijgevolg de cellen los maken en dat gaan we doen
met trypsine. Die losse cellen brengen we deels terug in een nieuwe
cultuurfles met medium. Een ander deel ga je invriezen in vloeibaar
stikstof = cryostok. Dit gaan we blijven herhalen. Na zoveel
passages gaan die cellen heel oud zijn en niet meer zo goed kunnen
groeien. Dan moeten we terug jonge cellen hebben en die gaan we
nemen uit het cryostock (degene die het dichts zit bij de
oorsprong).
Kostprijs (versus proefdierexperimenten)
Miniaturisatie: kleine hoeveelheden monster en reagentia
Proefdierexperimenten zijn duur
- Celcultuur is veel goedkoper in vergelijking met
proefdierexperimenten en je kunt veel meer doen
- Bij proefdieren heb je ook veel meer stoffen nodig dan bij celcultuur
Ethiek
Je moet geen proefdieren voor gebruiken/opofferen
Hoofdstuk 1: inleiding
1. Geschiedenis
Oorsprong 1907: Ross Harrison heeft voor het eerst weefsel in leven proberen te
houden op een labotafel. Dit deed hij door kikkerweefsel isoleren (incubatoren
waren er namelijk nog niet in die tijd). Waarom een kikker? Omdat een kikker
koudbloedig is en dat is makkelijk te bewaren op kamertemperatuur weefsel
van de mens moet op 37 graden gehouden worden in incubatoren.
Er waren wel wat problemen
Lucht is niet steriel maar met antibiotica kan het misschien wel (eerste
antibioticum: penicilline)
Weefsel samen bloed, maar bloed is niet het ideale medium Rond 1950
was er een kanteling in de wetenschap, dus werd er gewerkt met
chemisch gedefinieerde cultuurmedia. Dit had als voordeel dat het medium
hetzelfde bleef. Niet alleen het weefsel groeide, maar ook microbacteriën.
Cellen groeien veel trager dan bacteriën, dus de bacteriën gaan de
voedingstoffen meepakken en gaan suikers omzetten tot melkzuur.
Hierdoor gaat de pH dalen en gaat de cellen kapot. Een middel om dit te
vermijden is antibiotica, maar dat was er in die niet tijd. Dit geneesmiddel
maakt het mogelijk dat cellen gaan groeien zonder micro-organismen. Met
de ontwikkeling van antibiotica kreeg celcultuur een boost.
Van cellen naar weefsel gaan, moet je cellen losmaken. Dit kun je doen door
trypsine (een enzym) toevoegen. Trypsine is een proteoase dat een eiwit gaat
splitsen. Door trypsine krijgen we cellen die los zijn, door antibiotica krijgen we
cellen zonder micro-organisme (steriele cellen) en dan gaan de cellen groeien
door chemisch gedefinieerde cultuurmedia (water + voedingsstoffen, zoals
glucose, vitamines, etc.).
Chemisch gedefinieerde cultuurmedia: we vertrekken van water en we voegen
alle bestanddelen nodig die de cel nodig heeft om te groeien, zoals eiwitten,
suikers… en chemisch gedefinieerd betekent dat je weet hoeveel je precies moet
toevoegen
Polio virus = kinderverlamming
Polio is een naakt virus & een RNA virus
Micro-organismen: bacteriën, parasieten, fungi, virussen. Virussen zijn
obligatoir intracellulair, m.a.w. die hebben cellen (= een gastheer) nodig
om te groeien. We hebben twee soorten cellen; naakt en envelop. Een
virusdeeltje bestaat uit een nucleuscapside (genetisch materiaal van de
vrius beschermen) met daarin DNA en RNA. Bij het naaktvirus staan op die
nucleuscapside glycoproteïnen op (spikes) waarmee het vast kan hechten
op de receptor van de cel en zo kan binnendringen. Een voorbeeld van een
naakt virus is polio. Een envelop virus heeft rond de nucleuscapside nog
eens een envelop waarop spikes staan waarmee het zich kan vasthechten.
, Polio virus gaat zich hechten op de receptor van de cel en dit gaat het
virus doen aan de hand van de spike die hij zelf heeft
Rond WOII was er een pandemie van het polio virus. Polio kan leiden tot
verlamming (asymmetrisch). Rond de jaren 50 kwam de celcultuur op door die 3
aspecten. In 1949 kon me een virus uit cellen kweken, in dit geval polio.
Het polio virus kon gegroeid worden in cellen. in 1953 en 1957 zijn er twee
vaccins gekomen (door middel van een verschillende bereiding van het vaccin).
Optie 1: polio inactief maken
- dood virusdeeltje maken adhv formaldehyde (wordt gebruikt om
preparaten te behouden)
- structuur gaat door die formaldehyde behouden kunnen worden,
maar het organisme gaat toch dood
- Eiwitten gaan niet meer kunnen functioneren, dus idem voor de
enzymes
- Voor vaccins moet de buitenste structuur behouden blijven (zie foto
hierboven)
Levend verzwakt polio vaccin
- We gaan het zo maken dat het virus enkel kan groeien in de
celcultuur maar niet bij de mens we gaan dat virusdeeltje dat bij
de mens goed kan groeien, gaan we in het labo laten kweken, maar
we gaan maken dat het minder goed gaat groeien bij de mens maar
wel goed in het labo.
- Cellen gaan zich in de fles vasthechten en daarboven doe je medium
(= cultuurmedium) monolaag 1 laag op het oppervlak dat niet
gaat groeien. Virusdeeltje komt in de cel. Als 1 virusdeeltje
binnenkomt, komen er 100-en vrij die de anderen gaan infecteren
dus krijg je een virusfabriek.
- Bij deze techniek worden de virusdeeltjes gecollecteerd, worden die
in een nieuwe fles gebracht met opnieuw cellen en dan krijg je terug
hetzelfde. Als je dat blijft doen, gaan die enkel nog maar kunnen
groeien in het medium met deze opstelling.
- Virussen die heel verzwakt zijn en dus geen mens of dier meer
kwaad kunnen doen, nemen we dan en gebruiken we als vaccin
levend verzwakt vaccin
,HELA cells
Vernoemd naar Henriette Lacks. Ze had baarmoederhalskanker
(veroorzaakt door het humaan papillon virus). Ze is daaraan overleden in
het jaar ’51, maar men heeft haar kankercellen bijgehouden. Dit is één
van de cellijnen die het eerst gebruikt werden in labo’s.
Veelvuldig gebruikt bij kankeronderzoek
Hybridoma-technologie
1975: Köhler en Milstein
Technologie om monoklonale antilichamen te
produceren (belangrijk in de farmacie)
- Muis infecteren met antigen
- B-cellen komen vrij.
- We gaan bij dat dier de B-cellen isoleren
(de milt wordt er dus eerst uitgehaald en
daarna vindt de isolatie plaats).
- B-cellen maken antilichamen aan
Probleem als je die cellen 10-tal jaren wilt gebruiken om
antilichamen te produceren? Die B-cellen gaan op een
bepaalde afsterven
- We gaan een continu cel maken die de antilichamen kan blijven
aanmaken (= dat is een tumor dat kan blijven groeien)
- PEG (= poly-ethyleen glycol) is een stof die zorgt dat die tumorale
cellen met die B-cellen kunnen fuseren hybridoma’s
- Die hybridoma’s worden dan samen in een petrischaaltje gebracht
met andere antigenen na wegwassen blijven enkel de gebonden
antilichamen hangen monoclonale antilichamen (1 enkele soort
antilichaam geïsoleerd)
- Wanneer je de juiste cellen hebt, kun je die laten groeien
Cel- en weefseltechnologie
Implantaten
Skingrafting: brandwonden, diabetesvoet
- Diabetes wonden gaan niet zoals bij normale mensen genezen,
waardoor er misschien iets moet worden geamputeerd (bv. een
zwarte teen)
- Diabetes patiënt probleem met insuline. Insuline in pancreas aan
gemaakt (eilandjes van Langerhans). Bij transplantatie 80% cellen
weg, geen oplossing.
- Oplossing: Cellen van Langerhans aanmaken en binnenbrengen in
patiënt met scaffle. Aanbrengen aan bloedbaan.
- Rode kleur: pH-indicator (rood: pH=neutraal)
- Ook belangrijk voor verminderen van infectie gevaar
- Weefsel: verschillende soorten cellen
- Weefsel kapotmaken met trypsine aparte cellen
, - Cellen moeten we gaan kweken in een cultuurfles (onderaan: substraat
= oppervlak waar we cellen aan kunnen vasthechten) met daarboven:
cultuurmedium
- Cellen groeien tot monolaag
Als je die cellen gewoon een week laat staan, komen die
cellen los en gaan ze dood
- Juist voor de monolaag er is, moet je trypsine toevoegen
- Subcultivatie/Passage, waarbij je cellen in een nieuwe cultuurfles gaat
brengen gaat terug naar de eerste stap waar we cellen kweken
2. Voordelen
Controle van de omgeving
Fysicochemische parameters: pH, temp, osm druk, O2 en CO2
- Ph = neutraal (7,2) bacteriën hebben een veel groter bereik dan
cellen (komen zowel voor bij Ph 8 als zelfs Ph 6)
- Temperatuur in incubatoren: 35-37°C
- Osmotische druk: isotoon (0,9% Na)
- 21% O2 en 0,03% CO2 (CO2 bicarbonaat buffer andere
percentage)
Fysiologische parameters: voedingsstoffen (+ % serum)
Karakterisatie en homogeniteit
Redelijk homogeen: 1 type cellen, maar normale cellen verouderen. Dan is
het belangrijk om een cryostock aan te maken.
- Stel we maken een klein bioptje (fibroblasten) in een medium. Dit
brengen we dan in een cultuurfles. Na een week heb je een
monolaag in je cultuurfles. Dan moet je actie ondernemen en dat
noemt men subcultiseren = passeren = overbrengen van 1
cultuurfles naar een andere cultuurfles, want anders gaan de cellen
dood. Je moet bijgevolg de cellen los maken en dat gaan we doen
met trypsine. Die losse cellen brengen we deels terug in een nieuwe
cultuurfles met medium. Een ander deel ga je invriezen in vloeibaar
stikstof = cryostok. Dit gaan we blijven herhalen. Na zoveel
passages gaan die cellen heel oud zijn en niet meer zo goed kunnen
groeien. Dan moeten we terug jonge cellen hebben en die gaan we
nemen uit het cryostock (degene die het dichts zit bij de
oorsprong).
Kostprijs (versus proefdierexperimenten)
Miniaturisatie: kleine hoeveelheden monster en reagentia
Proefdierexperimenten zijn duur
- Celcultuur is veel goedkoper in vergelijking met
proefdierexperimenten en je kunt veel meer doen
- Bij proefdieren heb je ook veel meer stoffen nodig dan bij celcultuur
Ethiek
Je moet geen proefdieren voor gebruiken/opofferen
