1. Nested PCR
Het proces van nested PCR omvat twee opeenvolgende PCR-amplificatiereacties, waarbij de tweede
reactie gebruikmaakt van een deel van het product van de eerste reactie als template.
Hier is een overzicht van de stappen in een nested PCR-protocol:
Eerste ronde PCR (outer PCR): De reactiemix bevat de DNA-template, primers die specifiek zijn voor de
doelsequentie en het DNA-polymerase. Deze reactie versterkt een groter fragment van het doel-DNA,
inclusief de specifieke doelsequentie.
Tussenstap: Een kleine hoeveelheid van het product van de eerste ronde PCR wordt vervolgens
overgebracht naar een tweede PCR-reactiebuis.
Tweede ronde PCR (inner PCR): De reactiemix voor de tweede ronde PCR bevat de overgedragen DNA-
monsters uit de eerste ronde PCR als template, samen met een andere set van interne primers die zich
specifiek binden aan de doelsequentie binnen het vergrote fragment. Het DNA-polymerase versterkt
nu een kleinere, specifiekere sequentie die zich binnen het grotere fragment bevindt.
2. Hot start PCR
Hot start PCR introduceert een extra stap om deze problemen te verminderen. De reactiemix bevat
een hittebestendig modificatie-antilichaam of een speciale hittegevoelige oligonucleotide. Deze
componenten remmen de activiteit van het DNA-polymerase tijdens de opwarmingsstap van de PCR-
reactie.
Tijdens de opwarmingsstap wordt de reactiemix verhit tot een temperatuur waarbij het antilichaam of
de oligonucleotide zijn inhibitie-eigenschappen verliest. Dit maakt het mogelijk dat het DNA-
polymerase zijn enzymatische activiteit kan hervatten en de PCR-reactie kan starten. Hierdoor wordt
de achtergrondreactiviteit sterk verminderd en neemt de specificiteit en gevoeligheid van de PCR-
reactie toe.
3. Touch down PCR
Het basisprincipe van touchdown PCR is het geleidelijk verlagen van de annealingstemperatuur tijdens
de eerste paar PCR-cycli. Hierdoor kunnen de primers zich aanvankelijk binden aan de doelsequentie
met een hogere specificiteit, terwijl niet-specifieke bindingen worden verminderd.
Hier is een overzicht van de stappen in een touchdown PCR-protocol:
Verhoogde annealingstemperatuur: In de eerste paar cycli van de PCR-reactie wordt een hogere
annealingstemperatuur gebruikt dan de verwachte optimale temperatuur voor de primerbinding. Dit
kan 3-5 °C hoger zijn dan de geschatte Tm (smelttemperatuur) van de primers.
Geleidelijke verlaging van de annealingstemperatuur: Na de initiële cycli wordt de
annealingstemperatuur geleidelijk verlaagd met elke volgende cyclus. Meestal wordt de temperatuur
met 1-2 °C verlaagd totdat de optimale annealingstemperatuur wordt bereikt.
Optimale annealingstemperatuur: Zodra de optimale annealingstemperatuur is bereikt, wordt deze
temperatuur gehandhaafd voor de rest van de PCR-cycli.
Door deze geleidelijke verlaging van de annealingstemperatuur in de vroege cycli van de PCR-reactie,
wordt de kans op niet-specifieke bindingen en primer-dimerformatie verminderd. Dit komt doordat de
primers zich aanvankelijk sterker richten op de doelsequentie met een hogere annealingstemperatuur,
en pas later de temperatuur wordt verlaagd om de minder specifieke bindingen toe te staan.
1
, 4. RT-PCR
Hier is een overzicht van de stappen in een RT-PCR-protocol:
Reverse transcriptie (RT): Het RNA wordt eerst omgezet in complementair DNA (cDNA) door middel
van een enzym genaamd reverse transcriptase. Dit enzym synthetiseert een enkelstrengs cDNA-
molecuul dat complementair is aan het RNA-sjabloon.
PCR-reactie: Het cDNA dat is gesynthetiseerd tijdens de RT-stap wordt vervolgens gebruikt als
template voor de PCR-reactie. Hier worden specifieke primers toegevoegd die complementair zijn aan
de sequenties van de doel-genen. Deze primers binden aan de flankerende regio's van de
doelsequenties.
PCR-cycli: De PCR-reactie ondergaat verschillende cycli van denaturatie, annealing en verlenging, zoals
bij conventionele PCR. Tijdens de verlengingsstap synthetiseert het DNA-polymerase nieuwe DNA-
strengen die complementair zijn aan de doelsequenties.
Analyse van de resultaten: Na voltooiing van de PCR-cycli worden de versterkte DNA-producten
geanalyseerd met behulp van technieken zoals gelelektroforese, DNA-sequencing of andere
detectiemethoden om de aanwezigheid en kwantiteit van de specifieke genen te bepalen.
RT-PCR is een krachtige techniek die wordt gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden, zoals
genexpressieonderzoek, virale detectie, kankeronderzoek en diagnostiek. Het stelt onderzoekers in
staat om RNA-moleculen om te zetten in stabielere DNA-moleculen en vervolgens de aanwezigheid en
hoeveelheid van specifieke genen te meten. Het is vooral handig wanneer men geïnteresseerd is in het
bestuderen van genexpressie op het niveau van RNA-transcriptie, omdat het de mogelijkheid biedt om
de dynamiek van genexpressie te onderzoeken in verschillende celtypen, weefsels of omstandigheden.
5. Multiplex PCR
Het proces van multiplex PCR omvat het gebruik van meerdere sets van specifieke primers, die elk
gericht zijn op verschillende doelsequenties. Deze primers worden toegevoegd aan de reactiemix
samen met de DNA-template en het DNA-polymerase.
Hier is een overzicht van de stappen in een multiplex PCR-protocol:
Ontwerp van specifieke primers: Verschillende sets van primers worden ontworpen om
complementair te zijn aan de specifieke doelsequenties die tegelijkertijd moeten worden versterkt. Elk
paar primers bindt zich aan de flankerende regio's van de doelsequenties.
Reactiemix: De reactiemix bevat het DNA-monster dat de doelsequenties bevat, evenals de
verschillende sets van primers, DNA-polymerase en de benodigde nucleotiden.
PCR-cycli: De PCR-reactie ondergaat verschillende cycli van denaturatie, annealing en verlenging, zoals
bij conventionele PCR. De reactiecondities (temperatuur, tijd) moeten worden geoptimaliseerd om
ervoor te zorgen dat de verschillende sets van primers efficiënt binden en de gewenste amplificatie
plaatsvindt.
Analyse van de resultaten: Na voltooiing van de PCR-cycli worden de producten geanalyseerd met
behulp van technieken zoals gelelektroforese, DNA-sequencing of andere detectiemethoden om de
aanwezigheid en grootte van de versterkte fragmenten te bepalen. Door de verschillende sets van
primers te labelen met verschillende detectiekleurstoffen of fluorochromen, kunnen de resulterende
PCR-producten worden onderscheiden en geïdentificeerd.
2
Het proces van nested PCR omvat twee opeenvolgende PCR-amplificatiereacties, waarbij de tweede
reactie gebruikmaakt van een deel van het product van de eerste reactie als template.
Hier is een overzicht van de stappen in een nested PCR-protocol:
Eerste ronde PCR (outer PCR): De reactiemix bevat de DNA-template, primers die specifiek zijn voor de
doelsequentie en het DNA-polymerase. Deze reactie versterkt een groter fragment van het doel-DNA,
inclusief de specifieke doelsequentie.
Tussenstap: Een kleine hoeveelheid van het product van de eerste ronde PCR wordt vervolgens
overgebracht naar een tweede PCR-reactiebuis.
Tweede ronde PCR (inner PCR): De reactiemix voor de tweede ronde PCR bevat de overgedragen DNA-
monsters uit de eerste ronde PCR als template, samen met een andere set van interne primers die zich
specifiek binden aan de doelsequentie binnen het vergrote fragment. Het DNA-polymerase versterkt
nu een kleinere, specifiekere sequentie die zich binnen het grotere fragment bevindt.
2. Hot start PCR
Hot start PCR introduceert een extra stap om deze problemen te verminderen. De reactiemix bevat
een hittebestendig modificatie-antilichaam of een speciale hittegevoelige oligonucleotide. Deze
componenten remmen de activiteit van het DNA-polymerase tijdens de opwarmingsstap van de PCR-
reactie.
Tijdens de opwarmingsstap wordt de reactiemix verhit tot een temperatuur waarbij het antilichaam of
de oligonucleotide zijn inhibitie-eigenschappen verliest. Dit maakt het mogelijk dat het DNA-
polymerase zijn enzymatische activiteit kan hervatten en de PCR-reactie kan starten. Hierdoor wordt
de achtergrondreactiviteit sterk verminderd en neemt de specificiteit en gevoeligheid van de PCR-
reactie toe.
3. Touch down PCR
Het basisprincipe van touchdown PCR is het geleidelijk verlagen van de annealingstemperatuur tijdens
de eerste paar PCR-cycli. Hierdoor kunnen de primers zich aanvankelijk binden aan de doelsequentie
met een hogere specificiteit, terwijl niet-specifieke bindingen worden verminderd.
Hier is een overzicht van de stappen in een touchdown PCR-protocol:
Verhoogde annealingstemperatuur: In de eerste paar cycli van de PCR-reactie wordt een hogere
annealingstemperatuur gebruikt dan de verwachte optimale temperatuur voor de primerbinding. Dit
kan 3-5 °C hoger zijn dan de geschatte Tm (smelttemperatuur) van de primers.
Geleidelijke verlaging van de annealingstemperatuur: Na de initiële cycli wordt de
annealingstemperatuur geleidelijk verlaagd met elke volgende cyclus. Meestal wordt de temperatuur
met 1-2 °C verlaagd totdat de optimale annealingstemperatuur wordt bereikt.
Optimale annealingstemperatuur: Zodra de optimale annealingstemperatuur is bereikt, wordt deze
temperatuur gehandhaafd voor de rest van de PCR-cycli.
Door deze geleidelijke verlaging van de annealingstemperatuur in de vroege cycli van de PCR-reactie,
wordt de kans op niet-specifieke bindingen en primer-dimerformatie verminderd. Dit komt doordat de
primers zich aanvankelijk sterker richten op de doelsequentie met een hogere annealingstemperatuur,
en pas later de temperatuur wordt verlaagd om de minder specifieke bindingen toe te staan.
1
, 4. RT-PCR
Hier is een overzicht van de stappen in een RT-PCR-protocol:
Reverse transcriptie (RT): Het RNA wordt eerst omgezet in complementair DNA (cDNA) door middel
van een enzym genaamd reverse transcriptase. Dit enzym synthetiseert een enkelstrengs cDNA-
molecuul dat complementair is aan het RNA-sjabloon.
PCR-reactie: Het cDNA dat is gesynthetiseerd tijdens de RT-stap wordt vervolgens gebruikt als
template voor de PCR-reactie. Hier worden specifieke primers toegevoegd die complementair zijn aan
de sequenties van de doel-genen. Deze primers binden aan de flankerende regio's van de
doelsequenties.
PCR-cycli: De PCR-reactie ondergaat verschillende cycli van denaturatie, annealing en verlenging, zoals
bij conventionele PCR. Tijdens de verlengingsstap synthetiseert het DNA-polymerase nieuwe DNA-
strengen die complementair zijn aan de doelsequenties.
Analyse van de resultaten: Na voltooiing van de PCR-cycli worden de versterkte DNA-producten
geanalyseerd met behulp van technieken zoals gelelektroforese, DNA-sequencing of andere
detectiemethoden om de aanwezigheid en kwantiteit van de specifieke genen te bepalen.
RT-PCR is een krachtige techniek die wordt gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden, zoals
genexpressieonderzoek, virale detectie, kankeronderzoek en diagnostiek. Het stelt onderzoekers in
staat om RNA-moleculen om te zetten in stabielere DNA-moleculen en vervolgens de aanwezigheid en
hoeveelheid van specifieke genen te meten. Het is vooral handig wanneer men geïnteresseerd is in het
bestuderen van genexpressie op het niveau van RNA-transcriptie, omdat het de mogelijkheid biedt om
de dynamiek van genexpressie te onderzoeken in verschillende celtypen, weefsels of omstandigheden.
5. Multiplex PCR
Het proces van multiplex PCR omvat het gebruik van meerdere sets van specifieke primers, die elk
gericht zijn op verschillende doelsequenties. Deze primers worden toegevoegd aan de reactiemix
samen met de DNA-template en het DNA-polymerase.
Hier is een overzicht van de stappen in een multiplex PCR-protocol:
Ontwerp van specifieke primers: Verschillende sets van primers worden ontworpen om
complementair te zijn aan de specifieke doelsequenties die tegelijkertijd moeten worden versterkt. Elk
paar primers bindt zich aan de flankerende regio's van de doelsequenties.
Reactiemix: De reactiemix bevat het DNA-monster dat de doelsequenties bevat, evenals de
verschillende sets van primers, DNA-polymerase en de benodigde nucleotiden.
PCR-cycli: De PCR-reactie ondergaat verschillende cycli van denaturatie, annealing en verlenging, zoals
bij conventionele PCR. De reactiecondities (temperatuur, tijd) moeten worden geoptimaliseerd om
ervoor te zorgen dat de verschillende sets van primers efficiënt binden en de gewenste amplificatie
plaatsvindt.
Analyse van de resultaten: Na voltooiing van de PCR-cycli worden de producten geanalyseerd met
behulp van technieken zoals gelelektroforese, DNA-sequencing of andere detectiemethoden om de
aanwezigheid en grootte van de versterkte fragmenten te bepalen. Door de verschillende sets van
primers te labelen met verschillende detectiekleurstoffen of fluorochromen, kunnen de resulterende
PCR-producten worden onderscheiden en geïdentificeerd.
2
