ANALYTISCHE
BIOCHEMIE 2
IDENTIFICATIE, KARAKTERISATIE EN KWANTIFICATIE
VAN BIOMOLECULEN
2e Bachelor Biomedische wetenschappen
2e Bachelor Biochemie en Biotechnologie
Universiteit Antwerpen
, RT
Analytische performantie, kwaliteitscontrole en kalibratie
ANALYTISCHE PERFORMANTIE
AARD VAN DE ANALYSE
Kwalita'eve analyse:
- Gebruikt voor iden:fica:e, detec:e of aantonen vd bestanddelen in preparaat, monster of staal
- Met de kwalita:eve analyse wil men weten welke substan:e er in een staal zit zonder de concentra:e te weten
Kwan'ta'eve analyse:
- Beoogt het inwinnen van informa:e omtrent de rela:eve hoeveelheid (gehalte, concentra:e) van één, meerdere
(par:ële analyse) of alle bestanddelen (totaalanalyse) aanwezig in een staal
- Als men 1 component van het staal wil bepalen gebeurt dit via Individuele analyse
o Bv. concentra:e glucose in serum
- Als men meerdere verwante componenten in het staal wil bepalen doet men dit a.d.h.v. groepsanalyse
o Bv. concentra:e van het totale eiwitgehalte in het serum
De kwan:ta:eve analyse berust op de me:ng van een fysische of fysico-chemische grootheid die rechtstreeks of onrechtstreeks
evenredig is met de hoeveelheid te doseren bestanddeel:
- Volume, gewicht - Stroomsterkte
- Massa - Radioac:viteit
- Lichtabsorp:e/-emissie/-fluorescen:e
BASISBEGRIPPEN
SPECIFICITEIT EN SELECTIVITEIT
Specificiteit
- Een reac:e is specifiek wanneer ze enkel doorgaat met het bestanddeel dat men wil onderzoeken.
- Voorbeeld: % van een groep zonder betreffende ziekte die m.b.v. test terecht als niet ziek worden geclassificeerd.
- In ideale omstandigheden is de test 100% specifiek
o D.w.z. dat het signaal 100% aZoms:g van het te onderzoeken bestanddeel.
- Hoe hoger de specificiteit van een test, hoe lager de sensiviteit.
- We kunnen de specificiteit van een test verbeteren door een aantal parameters aan te passen.
o pH, complexvorming, temperatuur, oxida:egraad, voorafgaande elimina:e interfererende factoren
Selec'viteit
- Een reac:e is selec'ef wanneer ze voorkeur vertoont voor het te onderzoeken bestanddeel, maar desondanks ook
posi:ef kan reageren op andere bestanddelen.
o Bv. transferine in serum bepalen: je beschikt over een test die de concentra:e aan transferine kan bepalen
maar die ook een signaal kan veroorzaken voor een aanverwant eiwit zoals ferri:ne.
- De test is dus selec:ef voor het bepalen van eiwi_en op zich maar niet voor 1 specifiek eiwit.
- In de prak:jk wil je dit niet en heb je dus een test nodig met een heel hoge specifiteit
1
, RT
GEVOELIGHEID (SENSITIVITEIT)
Gevoeligheid van een test wordt bepaald door de helling van de ijkcurve.
- Hoe hoger de helling, hoe hoger de sensi:viteit
De gevoeligheid drukt men ook wel uit als signaal per eenheidsconcentra:e
Voorbeeld: HIV test
- Bij een HIV test wil men de sensiviteit zo hoog mogelijk zodat we kunnen
vermijden dat er fout-nega:eve uitslagen zijn.
- Dit betekent dat men wil vermijden dat een ziek persoon toch als gezond getest wordt
Karakteris'eke concentra'e
- Voor bepaalde technieken gebruikt als maat voor gevoeligheid (bv. bij atomaire absorp:espectrometrie – zie later)
- Dit is de hoeveelheid van een te bepalen stof (in µg) die een absorban:e van 0,0044 (1% absorp:e) teweegbrengt
- Gepubliceerde gevoeligheidswaarden zijn een uitstekende referen:e voor het afstellen/kalibreren van de apparatuur of
het controleren of de anayles betrouwbaar is.
BLANCOBEPALING
Bepaling van de frac:e van het totaalsignaal dat niet te wijten is aan het te bepalen bestanddeel in het te analyseren staal
- Er dient steeds een blancobepaling uitgevoerd te worden, zodat je de blancobepaling kan adrekken van het resultaat.
Voorbeeld: bloedstaal verdunnen in een bepaald solvent (mogelijkheid dat het solvent niet 100% zuiver is)
- Aluminium (Al) in serum.
o Als je het staal verdunt in het solvent, zal je naast Al in het staal ook een kleine frac:e Al in het solvent meten.
o De gemeten frac:e aluminium in het solvent is de ruis.
o Om dit te voorkomen is het belangrijk dat vooraf de ruis van het solvent bepaald
o Als er ruis aanwezig is, kan je dit adrekken van het signaal dat je krijgt van je staal in het solvent
o Hierdoor verkrijgt men de effec:eve concentra:e van aluminium in het staal krijgt.
DETECTIE- EN KWANTIFICATIELIMIET
Detec'elimiet (limit of detec'on – LOD)
- Minimale concentra:e van de te bepalen stof die een signaal veroorzaakt dat tweemaal zo groot is als het
achtergrondsignaal (peak to peak noise)
- M.a.w. de conc. die een signaal/ruis verhouding (S/N = signal-to-noise) van 2 teweegbrengt
- Soms wordt ook de formule 3 x SD* blank signaal gebruikt
- Is van groter analy:sch belang dan de gevoeligheid gezien naast de signaalgroo_e ook het achtergrondsignaal in
rekening wordt gebracht.
- Met de detec:elimiet kan men geen concentra:e bepalen, wel aantonen dat het te bepalen bestanddeel aanwezig is
Kwan'fica'elimiet (limit of quan'fica'on – LOQ)
- Laagste concentra:e die kwan:ta:ef kan worden bepaald
- Ze wordt veelal gedefinieerd als 10 x de standaarddevia:e van het blanco singaal
- Met de kwan:fica:elimiet kan je een concentra:e bij het desbetreffende signaal van het te bepalen bestanddeel
berekenen
2
, RT
Detec'elimiet ≠ gevoeligheid !!!
Sensi:viteit
- De gevoeligheid van een methode wordt bepaald door de helling
van de ijkcurve. Hoe hoger de helling, hoe hoger de sensi:viteit
- Bij de sensi:viteit kijkt men enkel naar de signaalgrooGe
Detec:elimiet
- De detec:elimiet is de minimale concentra:e van de te bepalen
stof die een signaal veroorzaak dat 2x zo groot is als het
achtergrondsignaal
- Bij de detec:elimiet wordt het achtergrondsignaal mee in
rekening gebracht
Figuur
- De sensi:viteit van methode A en B zijn gelijk aan elkaar omdat de helling van de ijkcurve gelijk is
- De detec:elimiet bij methode B is kleiner en dus beter dan die van methode A
o Bij methode A heb je een groter achtergrondsignaal
o Hoe kleiner het achtergrondsignaal, de pieken, hoe beter de detec:elimiet
ACCURAATHEID EN PRECISIE
Accuraatheid:
- maat voor de afwijking vd gemeten waarden t.o.v. onbekende werkelijk waarde
- In de meeste gevallen stelt men bepaalde eisen aan de accuraatheid (bv. max afwijking: 5%)
- Het probleem van een goede accuraatheid is dat het gemiddelde verschuid
Precisie (reproduceerbaarheid):
- maat voor de reproduceerbaarheid van analyseresultaten
- het probleem van een goede precisie is dat de standaardafwijking s:jgt
- als maat voor de precisie gebruikt men ook de term varia:ecoëfficiënt
o De varia:ecoëficiënt wordt bepaald als de standaarddevia:e (SD) van de verschillende me:ngen van hetzelfde
staal/gemiddelde waarde (µ) van de verschillende me:ngen van het staal
𝑆𝐷
𝑉𝐶 =
𝜇
Hoe hoger de VC, hoe minder precies à strikt genomen reflecteert de varia:ecoëfficiënt dus de imprecisie
Intra-varia:ecoëfficiënt (within run precision / repeatablility):
- Gemiddelde afwijking tegenover het gemiddelde binnen dezelfde run en dus onder dezelfde condi:e
- Bv. je hebt 1 staal en meet dit 20x na elkaar
Inter-varia:ecoëfficiënt (between run precision / reproducibility):
- Gemiddelde afwijking tegenover het gemiddelde bij verschillende runs en dus onder verschillende condi:es
- Bv. vandaag 20 me:ngen doen, morgen 20. Er worden andere verdunningen gebruikt…
De standaarddevia:e ligt hoger bij de inter-varia:ecoëfficiënt.
- De standaarddevia:e is heel hoog bij de inter-varia:ecoëfficiënt waardoor het een slechte reproduceerbare methode is
Een goede precisie wil niet zeggen dat we automa:sch een goede accuraatheid hebben!
Zowel de precisie als de accuraatheid van een analy:sche methode moet bepaald worden bij verschillende concentra:es
3
BIOCHEMIE 2
IDENTIFICATIE, KARAKTERISATIE EN KWANTIFICATIE
VAN BIOMOLECULEN
2e Bachelor Biomedische wetenschappen
2e Bachelor Biochemie en Biotechnologie
Universiteit Antwerpen
, RT
Analytische performantie, kwaliteitscontrole en kalibratie
ANALYTISCHE PERFORMANTIE
AARD VAN DE ANALYSE
Kwalita'eve analyse:
- Gebruikt voor iden:fica:e, detec:e of aantonen vd bestanddelen in preparaat, monster of staal
- Met de kwalita:eve analyse wil men weten welke substan:e er in een staal zit zonder de concentra:e te weten
Kwan'ta'eve analyse:
- Beoogt het inwinnen van informa:e omtrent de rela:eve hoeveelheid (gehalte, concentra:e) van één, meerdere
(par:ële analyse) of alle bestanddelen (totaalanalyse) aanwezig in een staal
- Als men 1 component van het staal wil bepalen gebeurt dit via Individuele analyse
o Bv. concentra:e glucose in serum
- Als men meerdere verwante componenten in het staal wil bepalen doet men dit a.d.h.v. groepsanalyse
o Bv. concentra:e van het totale eiwitgehalte in het serum
De kwan:ta:eve analyse berust op de me:ng van een fysische of fysico-chemische grootheid die rechtstreeks of onrechtstreeks
evenredig is met de hoeveelheid te doseren bestanddeel:
- Volume, gewicht - Stroomsterkte
- Massa - Radioac:viteit
- Lichtabsorp:e/-emissie/-fluorescen:e
BASISBEGRIPPEN
SPECIFICITEIT EN SELECTIVITEIT
Specificiteit
- Een reac:e is specifiek wanneer ze enkel doorgaat met het bestanddeel dat men wil onderzoeken.
- Voorbeeld: % van een groep zonder betreffende ziekte die m.b.v. test terecht als niet ziek worden geclassificeerd.
- In ideale omstandigheden is de test 100% specifiek
o D.w.z. dat het signaal 100% aZoms:g van het te onderzoeken bestanddeel.
- Hoe hoger de specificiteit van een test, hoe lager de sensiviteit.
- We kunnen de specificiteit van een test verbeteren door een aantal parameters aan te passen.
o pH, complexvorming, temperatuur, oxida:egraad, voorafgaande elimina:e interfererende factoren
Selec'viteit
- Een reac:e is selec'ef wanneer ze voorkeur vertoont voor het te onderzoeken bestanddeel, maar desondanks ook
posi:ef kan reageren op andere bestanddelen.
o Bv. transferine in serum bepalen: je beschikt over een test die de concentra:e aan transferine kan bepalen
maar die ook een signaal kan veroorzaken voor een aanverwant eiwit zoals ferri:ne.
- De test is dus selec:ef voor het bepalen van eiwi_en op zich maar niet voor 1 specifiek eiwit.
- In de prak:jk wil je dit niet en heb je dus een test nodig met een heel hoge specifiteit
1
, RT
GEVOELIGHEID (SENSITIVITEIT)
Gevoeligheid van een test wordt bepaald door de helling van de ijkcurve.
- Hoe hoger de helling, hoe hoger de sensi:viteit
De gevoeligheid drukt men ook wel uit als signaal per eenheidsconcentra:e
Voorbeeld: HIV test
- Bij een HIV test wil men de sensiviteit zo hoog mogelijk zodat we kunnen
vermijden dat er fout-nega:eve uitslagen zijn.
- Dit betekent dat men wil vermijden dat een ziek persoon toch als gezond getest wordt
Karakteris'eke concentra'e
- Voor bepaalde technieken gebruikt als maat voor gevoeligheid (bv. bij atomaire absorp:espectrometrie – zie later)
- Dit is de hoeveelheid van een te bepalen stof (in µg) die een absorban:e van 0,0044 (1% absorp:e) teweegbrengt
- Gepubliceerde gevoeligheidswaarden zijn een uitstekende referen:e voor het afstellen/kalibreren van de apparatuur of
het controleren of de anayles betrouwbaar is.
BLANCOBEPALING
Bepaling van de frac:e van het totaalsignaal dat niet te wijten is aan het te bepalen bestanddeel in het te analyseren staal
- Er dient steeds een blancobepaling uitgevoerd te worden, zodat je de blancobepaling kan adrekken van het resultaat.
Voorbeeld: bloedstaal verdunnen in een bepaald solvent (mogelijkheid dat het solvent niet 100% zuiver is)
- Aluminium (Al) in serum.
o Als je het staal verdunt in het solvent, zal je naast Al in het staal ook een kleine frac:e Al in het solvent meten.
o De gemeten frac:e aluminium in het solvent is de ruis.
o Om dit te voorkomen is het belangrijk dat vooraf de ruis van het solvent bepaald
o Als er ruis aanwezig is, kan je dit adrekken van het signaal dat je krijgt van je staal in het solvent
o Hierdoor verkrijgt men de effec:eve concentra:e van aluminium in het staal krijgt.
DETECTIE- EN KWANTIFICATIELIMIET
Detec'elimiet (limit of detec'on – LOD)
- Minimale concentra:e van de te bepalen stof die een signaal veroorzaakt dat tweemaal zo groot is als het
achtergrondsignaal (peak to peak noise)
- M.a.w. de conc. die een signaal/ruis verhouding (S/N = signal-to-noise) van 2 teweegbrengt
- Soms wordt ook de formule 3 x SD* blank signaal gebruikt
- Is van groter analy:sch belang dan de gevoeligheid gezien naast de signaalgroo_e ook het achtergrondsignaal in
rekening wordt gebracht.
- Met de detec:elimiet kan men geen concentra:e bepalen, wel aantonen dat het te bepalen bestanddeel aanwezig is
Kwan'fica'elimiet (limit of quan'fica'on – LOQ)
- Laagste concentra:e die kwan:ta:ef kan worden bepaald
- Ze wordt veelal gedefinieerd als 10 x de standaarddevia:e van het blanco singaal
- Met de kwan:fica:elimiet kan je een concentra:e bij het desbetreffende signaal van het te bepalen bestanddeel
berekenen
2
, RT
Detec'elimiet ≠ gevoeligheid !!!
Sensi:viteit
- De gevoeligheid van een methode wordt bepaald door de helling
van de ijkcurve. Hoe hoger de helling, hoe hoger de sensi:viteit
- Bij de sensi:viteit kijkt men enkel naar de signaalgrooGe
Detec:elimiet
- De detec:elimiet is de minimale concentra:e van de te bepalen
stof die een signaal veroorzaak dat 2x zo groot is als het
achtergrondsignaal
- Bij de detec:elimiet wordt het achtergrondsignaal mee in
rekening gebracht
Figuur
- De sensi:viteit van methode A en B zijn gelijk aan elkaar omdat de helling van de ijkcurve gelijk is
- De detec:elimiet bij methode B is kleiner en dus beter dan die van methode A
o Bij methode A heb je een groter achtergrondsignaal
o Hoe kleiner het achtergrondsignaal, de pieken, hoe beter de detec:elimiet
ACCURAATHEID EN PRECISIE
Accuraatheid:
- maat voor de afwijking vd gemeten waarden t.o.v. onbekende werkelijk waarde
- In de meeste gevallen stelt men bepaalde eisen aan de accuraatheid (bv. max afwijking: 5%)
- Het probleem van een goede accuraatheid is dat het gemiddelde verschuid
Precisie (reproduceerbaarheid):
- maat voor de reproduceerbaarheid van analyseresultaten
- het probleem van een goede precisie is dat de standaardafwijking s:jgt
- als maat voor de precisie gebruikt men ook de term varia:ecoëfficiënt
o De varia:ecoëficiënt wordt bepaald als de standaarddevia:e (SD) van de verschillende me:ngen van hetzelfde
staal/gemiddelde waarde (µ) van de verschillende me:ngen van het staal
𝑆𝐷
𝑉𝐶 =
𝜇
Hoe hoger de VC, hoe minder precies à strikt genomen reflecteert de varia:ecoëfficiënt dus de imprecisie
Intra-varia:ecoëfficiënt (within run precision / repeatablility):
- Gemiddelde afwijking tegenover het gemiddelde binnen dezelfde run en dus onder dezelfde condi:e
- Bv. je hebt 1 staal en meet dit 20x na elkaar
Inter-varia:ecoëfficiënt (between run precision / reproducibility):
- Gemiddelde afwijking tegenover het gemiddelde bij verschillende runs en dus onder verschillende condi:es
- Bv. vandaag 20 me:ngen doen, morgen 20. Er worden andere verdunningen gebruikt…
De standaarddevia:e ligt hoger bij de inter-varia:ecoëfficiënt.
- De standaarddevia:e is heel hoog bij de inter-varia:ecoëfficiënt waardoor het een slechte reproduceerbare methode is
Een goede precisie wil niet zeggen dat we automa:sch een goede accuraatheid hebben!
Zowel de precisie als de accuraatheid van een analy:sche methode moet bepaald worden bij verschillende concentra:es
3
