SMV MEDICAL GENOMICS (2)
Genome manipulation
Genoom manipulatie is het genoom op een bewuste manier veranderen via reverse
genetics. Er zijn vier methoden waarop dit kan.
Transgenese
Bij transgenese breng je een gen op een willekeurige plaats in het genoom in. Je kan ook
niet bewust een endogeen gen (wildtype gen) weghalen. Het kan wel voorkomen dat jouw
gen perongeluk in het ORF van een ander gen terechtkomt, omdat de plaatsing random is.
Dit is meer een off-target effect, deze kunnen bij deze methode dus wel plaatsvinden. Je
hebt niet perse proefdieren, je kunt het ook toepassen in primaire cellijnen.
Methode
In levende cellen ontstaat vaak een breuk in een dubbelstrengs stukje DNA (DSB). De
voornaamste repair methode van een DSB is non homologous end joining (NHEJ). De twee
losse uiteinden worden herkent door een eiwitcomplex en ze worden aan elkaar geplakt.
Hierbij is geen proofreading mogelijk, waardoor je makkelijk een transgen kan inbrengen in
deze breuk. Dit is het mechanisme van transgenese. Je stopt meerdere transgenen in een
cel waarbij er uiteindelijk wel eentje in een breuk komt, de kans dat integratie plaatsvindt is
vrij hoog. Het transgen bevat alles wat bij een functioneel gen hoort. Afhankelijk van de
plaats van het transgen zal de promotor activiteit beïnvloedt worden, dit is het landing site
effect/position effect).
Standaard transgen construct
Het standaard transgen construct bevat een aantal elementen
- Promotor: zorgt ervoor dat het DNA wordt afgeschreven in mRNA.
- Open reading frame: er worden geen introns toegevoegd in het contract behalve
intron 1i. Dit doen ze omdat heel vaak op intron 1 nog essentiële regulatoire
sequenties voorkomen, en niet alleen op de promotor.
- Poly-A signaal: niet hetzelfde als poly-A staart in mRNA (AATAAA).
,Techniek
Het transgen wordt in een oöcyt ingebracht, eencellige embryo’s. De eicel bevat in dit
stadium twee pronuclei. Het transgene DNA wordt geïnjecteerd in 1 van de pronuclei waarbij
hij opzwelt. Om zo’n eicel te injecteren moet je hem vasthouden met een holding pipet. Met
een scherpe naald injecteer je 4 nanoliter met veel transgenen. Omdat de naald zo scherp is
zal bevruchte eicel zich snel herstellen. De cellen die zijn geïnjecteerd leg je in stoof bij 37
graden met een specifiek medium voor het embryo. Als de eicellen niet dood zijn gegaan en
zich bevinden in de tweecellige stadium inplanteer je het embryo in een draagmoeder.
Homologe gene targeting
Homologe gene targeting staat ook wel bekend als de knockout/knockin methode. Hierbij
wordt een chromosoom fragment vervangen door homologe recombinatie (double crossing
over). Hierbij kun je het integratie locus bepalen, en is dus niet random.
De enige nadelen van deze methode is dat het lang duurt, 1 jaar, en dat er perse
proefdieren voor nodig zijn. Je kan in principe wel primaire cellijnen gebruiken, maar dan
krijg je altijd een heterozygote cel. Je hebt proefdieren nodig om homozygoten te fokken uit
heterozygoten.
Methode
Als eerst moet je een artificieel construct maken. Door de ‘armen’ van dat construct
specifieke sequenties te geven kan je de integratie locus bepalen. Dan moet je wachten tot
er dubbele crossover plaatsvindt en het gen is vervangen door het construct. Dit gebeurt aan
de hand van dubbelstrengse breuk die wordt herstelt door homologe recombinatie. De kans
van dubbele crossover is klein, dus krijg je altijd heterozygoten: 1 wildtype en 1 mutant allel.
Techniek
Als eerste moet je de embryonale stamcellen (ES) kweken. Je wilt niet dat deze stamcellen
gaan differentiëren, want dan zijn ze niet meer pluripotent. Dit kun je voorkomen door mouse
embryonic fibroblasten (MEF) toe te voegen waardoor de cellen groeien in kolonies.
Daarnaast wordt ook leukemia inhibiting factor (LIF) toegevoegd, dit inhibeert differentiatie.
Vervolgens kun je de ES manipuleren door het DNA construct toe te voegen (transfectie).
Dit doe je met behulp van de elektroporatie methode. De ES krijgen een elektrische schok
waarbij het membraan even stuk gaat en het construct DNA naar binnen kan ‘zwemmen’. De
schok is niet heel heftig dus de cellen kunnen dit overleven. In het construct zijn twee dingen
aanwezig: twee flankerende gebieden die 100% identiek zijn aan de flankerende gebieden
van het gen van interesse en een selecteerbare maker. Deze selecteerbare marker is
meestal een neomycine resistentie gen.
Je kunt verkeerde integratie ook controleren. De goede integraties kan je namelijk
vermeerderen met PCR reactie door bepaalde primers toe te voegen waardoor de
ongewenste bijproducten niet vermeerderen.
, Als de ES zijn gemanipuleerd kun je injecteren in een wildtype embryo. Dit doe je in het
blastocyst stadium, deze heeft een lege holte aan de binnenkant waarin je de
gemanipuleerde ES kan injecteren. Dit gebeurt weer met behulp van een holding pipet en
een scherpe pipet waarbij 10-16 cellen worden geïnjecteerd. Deze vermengen zich niet met
de wildtype cellen, maar zullen zorgen voor chimera muizen die in het ene deel van lichaam
een ander genotype heeft dan een ander deel. Het is dus geen heterozygoot organisme.
De genetisch gemanipuleerde cellen wil je in de germline hebben dan komen ze terecht in
de nakomelingen van de muis. Er is een speciale manier om de muis te fokken. De moet de
namelijk de heterozygoot fokken met het originele wildtype muis. Zo is 100% van de rest van
de genen identiek en alleen de mutatie van interesse is homozygoot aanwezig.
Variatie van homologe gene targeting
1. Knockout: 0 allel (functieloos) wordt verkregen.
2. Knockin: mutant allel wordt verkregen. Hierbij kun je
onderzoeken of een bepaalde mutatie de oorzaak is van een
aandoening.
3. Conditionele knockouts (cre-lox systeem): floxed allel wordt
verkregen. Het wildtype gen wordt hierbij geflankeerd door loxP
sites. Dan wordt alleen als het enzym Cre tot expressie wordt
gebracht vindt het recombinatie event plaats en wordt het
wildtype allel een 0 allel. Zo kan je knockouts krijgen in
specifieke weefsel, bepaalde ontwikkelingsstadia of dieetafhankelijke situaties. De
promotor die Cre tot expressie brengt is de beslissende factor in wanneer een
knockout wordt geïnduceerd.
LoxP is een fragment DNA van 34 bp en bestaat uit twee delen inverted repeat aan
de buitenkanten en in het midden spacer site. Deze sit herkent het cre enzym en
wordt daar gecleared waardoor het een sticky end achterlaat. Geen restrictie site.
Als Cre tot expressie wordt gebracht vormen ze dimeren. Deze herkennen de
cleavage sites en wordt er een tetrameer gevormd van die Cre enzymen bij twee
loxP sites. Die loxP sites zijn al voldoende om het recombinatie event te
bewerkstelligen. Je krijgt 1 kopie van loxP site en verder niks. Alles wat er tussenin
zat vormt een circulaire fragment en gaat verloren bij de eerste celdeling. Bij knockin
moet je loxp sites weghalen en dan komt iets anders voor in de plaats (mutatie).
RNA interferentie (RNAi)
Bij RNA interferentie rem je de genexpressie van een gen door de stabiliteit van het mRNA
te reduceren. Je kunt hierbij 1 van de endogene genen inactiveren, maar je maakt hem niet
defect. Het is daarom onmogelijk om hem voor de 100% te inactiveren, hij wordt geremd tot
ongeveer 20%. Het hangt van het gen af of 20% voldoende is om functie uitoefenen. Je hebt
wel veel last van off-target effecten, je weet van te voren niet welk eiwit je remt. Dit kun je
ook doen in primair gekweekte cellijnen. Synoniemen zijn RNA/gene silencing methode of
knockdown.
Methode
Genome manipulation
Genoom manipulatie is het genoom op een bewuste manier veranderen via reverse
genetics. Er zijn vier methoden waarop dit kan.
Transgenese
Bij transgenese breng je een gen op een willekeurige plaats in het genoom in. Je kan ook
niet bewust een endogeen gen (wildtype gen) weghalen. Het kan wel voorkomen dat jouw
gen perongeluk in het ORF van een ander gen terechtkomt, omdat de plaatsing random is.
Dit is meer een off-target effect, deze kunnen bij deze methode dus wel plaatsvinden. Je
hebt niet perse proefdieren, je kunt het ook toepassen in primaire cellijnen.
Methode
In levende cellen ontstaat vaak een breuk in een dubbelstrengs stukje DNA (DSB). De
voornaamste repair methode van een DSB is non homologous end joining (NHEJ). De twee
losse uiteinden worden herkent door een eiwitcomplex en ze worden aan elkaar geplakt.
Hierbij is geen proofreading mogelijk, waardoor je makkelijk een transgen kan inbrengen in
deze breuk. Dit is het mechanisme van transgenese. Je stopt meerdere transgenen in een
cel waarbij er uiteindelijk wel eentje in een breuk komt, de kans dat integratie plaatsvindt is
vrij hoog. Het transgen bevat alles wat bij een functioneel gen hoort. Afhankelijk van de
plaats van het transgen zal de promotor activiteit beïnvloedt worden, dit is het landing site
effect/position effect).
Standaard transgen construct
Het standaard transgen construct bevat een aantal elementen
- Promotor: zorgt ervoor dat het DNA wordt afgeschreven in mRNA.
- Open reading frame: er worden geen introns toegevoegd in het contract behalve
intron 1i. Dit doen ze omdat heel vaak op intron 1 nog essentiële regulatoire
sequenties voorkomen, en niet alleen op de promotor.
- Poly-A signaal: niet hetzelfde als poly-A staart in mRNA (AATAAA).
,Techniek
Het transgen wordt in een oöcyt ingebracht, eencellige embryo’s. De eicel bevat in dit
stadium twee pronuclei. Het transgene DNA wordt geïnjecteerd in 1 van de pronuclei waarbij
hij opzwelt. Om zo’n eicel te injecteren moet je hem vasthouden met een holding pipet. Met
een scherpe naald injecteer je 4 nanoliter met veel transgenen. Omdat de naald zo scherp is
zal bevruchte eicel zich snel herstellen. De cellen die zijn geïnjecteerd leg je in stoof bij 37
graden met een specifiek medium voor het embryo. Als de eicellen niet dood zijn gegaan en
zich bevinden in de tweecellige stadium inplanteer je het embryo in een draagmoeder.
Homologe gene targeting
Homologe gene targeting staat ook wel bekend als de knockout/knockin methode. Hierbij
wordt een chromosoom fragment vervangen door homologe recombinatie (double crossing
over). Hierbij kun je het integratie locus bepalen, en is dus niet random.
De enige nadelen van deze methode is dat het lang duurt, 1 jaar, en dat er perse
proefdieren voor nodig zijn. Je kan in principe wel primaire cellijnen gebruiken, maar dan
krijg je altijd een heterozygote cel. Je hebt proefdieren nodig om homozygoten te fokken uit
heterozygoten.
Methode
Als eerst moet je een artificieel construct maken. Door de ‘armen’ van dat construct
specifieke sequenties te geven kan je de integratie locus bepalen. Dan moet je wachten tot
er dubbele crossover plaatsvindt en het gen is vervangen door het construct. Dit gebeurt aan
de hand van dubbelstrengse breuk die wordt herstelt door homologe recombinatie. De kans
van dubbele crossover is klein, dus krijg je altijd heterozygoten: 1 wildtype en 1 mutant allel.
Techniek
Als eerste moet je de embryonale stamcellen (ES) kweken. Je wilt niet dat deze stamcellen
gaan differentiëren, want dan zijn ze niet meer pluripotent. Dit kun je voorkomen door mouse
embryonic fibroblasten (MEF) toe te voegen waardoor de cellen groeien in kolonies.
Daarnaast wordt ook leukemia inhibiting factor (LIF) toegevoegd, dit inhibeert differentiatie.
Vervolgens kun je de ES manipuleren door het DNA construct toe te voegen (transfectie).
Dit doe je met behulp van de elektroporatie methode. De ES krijgen een elektrische schok
waarbij het membraan even stuk gaat en het construct DNA naar binnen kan ‘zwemmen’. De
schok is niet heel heftig dus de cellen kunnen dit overleven. In het construct zijn twee dingen
aanwezig: twee flankerende gebieden die 100% identiek zijn aan de flankerende gebieden
van het gen van interesse en een selecteerbare maker. Deze selecteerbare marker is
meestal een neomycine resistentie gen.
Je kunt verkeerde integratie ook controleren. De goede integraties kan je namelijk
vermeerderen met PCR reactie door bepaalde primers toe te voegen waardoor de
ongewenste bijproducten niet vermeerderen.
, Als de ES zijn gemanipuleerd kun je injecteren in een wildtype embryo. Dit doe je in het
blastocyst stadium, deze heeft een lege holte aan de binnenkant waarin je de
gemanipuleerde ES kan injecteren. Dit gebeurt weer met behulp van een holding pipet en
een scherpe pipet waarbij 10-16 cellen worden geïnjecteerd. Deze vermengen zich niet met
de wildtype cellen, maar zullen zorgen voor chimera muizen die in het ene deel van lichaam
een ander genotype heeft dan een ander deel. Het is dus geen heterozygoot organisme.
De genetisch gemanipuleerde cellen wil je in de germline hebben dan komen ze terecht in
de nakomelingen van de muis. Er is een speciale manier om de muis te fokken. De moet de
namelijk de heterozygoot fokken met het originele wildtype muis. Zo is 100% van de rest van
de genen identiek en alleen de mutatie van interesse is homozygoot aanwezig.
Variatie van homologe gene targeting
1. Knockout: 0 allel (functieloos) wordt verkregen.
2. Knockin: mutant allel wordt verkregen. Hierbij kun je
onderzoeken of een bepaalde mutatie de oorzaak is van een
aandoening.
3. Conditionele knockouts (cre-lox systeem): floxed allel wordt
verkregen. Het wildtype gen wordt hierbij geflankeerd door loxP
sites. Dan wordt alleen als het enzym Cre tot expressie wordt
gebracht vindt het recombinatie event plaats en wordt het
wildtype allel een 0 allel. Zo kan je knockouts krijgen in
specifieke weefsel, bepaalde ontwikkelingsstadia of dieetafhankelijke situaties. De
promotor die Cre tot expressie brengt is de beslissende factor in wanneer een
knockout wordt geïnduceerd.
LoxP is een fragment DNA van 34 bp en bestaat uit twee delen inverted repeat aan
de buitenkanten en in het midden spacer site. Deze sit herkent het cre enzym en
wordt daar gecleared waardoor het een sticky end achterlaat. Geen restrictie site.
Als Cre tot expressie wordt gebracht vormen ze dimeren. Deze herkennen de
cleavage sites en wordt er een tetrameer gevormd van die Cre enzymen bij twee
loxP sites. Die loxP sites zijn al voldoende om het recombinatie event te
bewerkstelligen. Je krijgt 1 kopie van loxP site en verder niks. Alles wat er tussenin
zat vormt een circulaire fragment en gaat verloren bij de eerste celdeling. Bij knockin
moet je loxp sites weghalen en dan komt iets anders voor in de plaats (mutatie).
RNA interferentie (RNAi)
Bij RNA interferentie rem je de genexpressie van een gen door de stabiliteit van het mRNA
te reduceren. Je kunt hierbij 1 van de endogene genen inactiveren, maar je maakt hem niet
defect. Het is daarom onmogelijk om hem voor de 100% te inactiveren, hij wordt geremd tot
ongeveer 20%. Het hangt van het gen af of 20% voldoende is om functie uitoefenen. Je hebt
wel veel last van off-target effecten, je weet van te voren niet welk eiwit je remt. Dit kun je
ook doen in primair gekweekte cellijnen. Synoniemen zijn RNA/gene silencing methode of
knockdown.
Methode
