Hoofdstuk 1: Methoden en technieken voor microscopie
Wat is histologie?
• Lichaamsdelen zijn opgebouwd uit:
- Epitheel
- Bindweefsel
- Spier
- Zenuwweefsel
• Weefsels zijn opgebouwd uit:
- Cellen
- ECM
- Vloeistof (bloed, interstitieel vocht, lymfe)
• Histologie = studie vd gedetailleerde structuur van weefsels
• Histopathologie = identificatie van ziekteproces/achterhalen van diagnose dmv
weefselonderzoek
• Onderzoeksterrein: organisme – orgaanstelsel – orgaan – weefsel – cel – organel –
macromolecule – molecule
- Organisme + orgaanstelsel: ANATOMIE = met blote oog; 100µm – 10m
- Anderen: HISTOLOGIE = microscoop; 100nm – 10mm
- Bijzondere histologie = CYTOLOGIE; 0.1nm- 10µm
• Soorten microscopen: Lichtmicroscopie – elektronen microscopie
➔ Meestal met klassieke microscopie, soms met fluorescentie microscoop
➔ Stel werken met levende/delende cellen: andere microscoop nodig (zie verder)
Lichtmicroscoop
• Oplossend vermogen = minimale afstand tussen 2 punten om ze als afzonderlijke
punten te herkennen
- Bij menselijk oog op afstand van 25cm: 70µm
- Stel toch dichter bij elkaar en we willen ze kunnen onderscheiden -> microscopie:
bij lichtmicroscopie wordt het beeld over een grotere hoek op het netvlies
geprojecteerd door een lenzenstelsel: 0,2µm => 500x nauwkeuriger dan blote
oog
• 3 lenssystemen:
- Condensor: bundelt het licht, vergroot niet
- Objectief: beeldt het objectief af, vergroot wel
- Oculair: lens om het beeld met het oog waar te
kunnen nemen, vergroot wel, zit dichtst bij oog
- Diafragma: bepaalt hoeveel licht er binnen komt
• 5 belangrijke delen:
1
, Uiteindelijk preparaat wordt door zowel objectieven als oculair vergroot
➔ Oculair: 1 vaste vergroting, meestal x10
➔ Objectieven: in verschillende stappen object vergroten: varieert
tussen x25 en x1000
1. Lichtbron:
- halogeen lampje
- regelbare intensiteit
- spiegel stuurt licht richting object
- – grootte verlichte veld w geregeld dmv velddiafragma (iris)
- eventueel kleurfilter
2. Lens die licht bundelt en op preparaat projecteert
- Condensor
- Brandpunt instellen zodat rand diafragma precies ih vlak van het preparaat valt
- Verstelschroef om hoogte brandpunt condensor correct in te stellen
3. Objecttafel
- Plaat waarop licht vd condensator kan invallen
- Kruistafel met 2 schuifbare assen
4. Lenzen om beeld te vergroten
- Eindvergroting = vergroting objectief x vergroting oculair
- Objectieven = voorwerplenzen; vormt een vergroot beeld uit het
licht dat door preparaat valt
➔ Hoe groter de vergroting, hoe kleiner de afstand van objectief tem
preparaat
➔ Heeft bepaalde numerieke apertuur(NA= n . sinѲ); houdt verband
met max. hoek waarmee licht invalt; stel veel vergroting -> grote
hoek -> grote NA en dat getal staat op objectief
➔ 0.17 = correctiefactor voor dekglas dat weefsel beschermt
- Via prisma wordt beeld verder geleid door tubus
- Oculair = ooglens; vergroot beeld verder tot virtueel beeld
- Resolutie = scheidend vermogen = kleinste afstand waarmee 2 punten nog net
gescheiden w weergegeven
5. Mechaniek om lenzen op juiste afstand te brengen tot het object
- Macro -en microschroef
- Preparaat wordt precies ih brandpunt vd objectieven gebracht zodat object
scherp w afgebeeld
• (contrastmicroscopie: verhogen contrast in ongekleurde preparaten)
• Fluorescentiemicroscopie: lokaliseren + kwantificeren van fluorescerende moleculen
in cellen – detectie door uitzenden van bepaalde golflengte na absorptie van licht
Technieken voor lichtmicroscopie
A.Voorbereiding van weefsels
• Te onderzoeken materiaal geschikt maken voor microscopisch onderzoek
2
, - Cytologie = individuele cellen; cellen uit te strijken / postief: snel / negatief: heel
beperkt, cellen iets verderop in weefsel kunnen wel iets kwaadaardig hebben
- Histologie = cellen in weefselverband, verhouding van cellen; dunne sneetjes te
maken / meer invasief maar meer info
1.herkomst van verse weefsels of cellen
a) Chirurgische resectie: bv niet hele darm onder microscoop -> stukjes nemen om
vragen te beantwoorden: welke tumor, is tumor volledig uit lichaam?
b) Biopsie:
- endoscopisch biopt
- core needle biopt CNB: met holle naald in bepaald orgaan prikken -> cilinders
- punchbiopt: vaak door huisarts genomen
- excisiebiopsie: bedoeling curatief te zijn; letsel verwijderen + letselvrije zone
- incisiebiopsie: diagnostisch, en dan afhankelijk van diagnose w bepaald hoe breed
rondom letsel gaan snijden
c) afzonderlijke cellen:
- FNAC = fine needle aspiration; cytologie
- Bv bij tumor in borstkas met broncoscoop EBUS-> echo -> naald en cellen nemen;
stel niet voldoende; borstkas opensnijden
- Vocht
- Cervixbrush: tussen haartjes van borstel blijven cellen zitten
- Bloed/beenmerguitstrijkje
2.ontvangst en voorbereiding
* labelling + weefsel inkten, openknippen en spoelen
* macroscopie: insnijden van solide
organen en op uitzicht bekijken of er een
tumor is
* weefsels zijn te groot om onder de
microscoop te leggen
* rottingsproces voorkomen:
koelen/fixeren/vers in bep. Medium
steken + GF toevoegen zodat
tumorcellen groeien, dan celdeling
stilleggen en karyotype bepalen
3. fixatie
* bewaren architectuur vh weefsel
* weefsel in oorspronkelijke toestand bewaren/verteringsprocessen ‘autolyse’ voorkomen
* structuur biomoleculen wijzigen: stoppen van eiwitactiviteit + componenten op hun plaats
houden
3
, • Reversibel -> vriescoupe: SNAP FREEZING; -180°C; heel snel heel koud maken;
enzymatische activiteit + RNA en DNA behouden; bv tijdens een operatie
• Irreversibel: fixatief -> FFPE = Formalin-Fixed Paraffin-Embedded;
- Formaldehyde gebaseerd: formol: reageert met AZ; denatureert proteinen, is
toxisch
- Alcohol
- Formol + parafine is soort kaarsvet om weefsel zo fijn te kunnen snijden, is
belangrijkste omdat uitzicht daar het beste is, min 2 dagen wachten
• IMMERSIE/PERFUSIE
- Immersie: weefsel in pot met fixatievloeistof (1:2), pot goed sluiten: formol
penetreert weefsels met snelheid van 1 mm per uur. Ook niet te lang anders te
hard
- Perfusie: vb fixatie vd longen; inspuiten met formol om ook binnenkant weefsels
te fixeren
B.Procedure maken van PARAFFINECOUPES (FFPE)
* kleuren is nodig om chirurgisch snedevlak aan te tonen, anders weet je niet wat sneden
zijn van de patholoog en of de tumor wel of niet volledig verwijderd is uit het lichaam
1. macroscopie en versnijden: bot decalcifiëren met mierenzuur
- Kleuring zegt niet alles want kan ook zijn dat indivuele cellen die niet zichtbaar zijn
met blote oog wel dieper in weefsel al zitten
2. inbedden = doordrenken met materiaal van hoge en uniforme hardheid
- Dehydratatie; weefsel bestaat voor 90% uit vocht -> allemaal verwijderen door
alcohol anders dringt parafine niet door
- Klaring (= alcohol verwijderen dmv tolueen/xyleen)
- Paraffinering
- Uitbedden
3. coupes snijden met microtoom = vervaardigen van dunne coupes (5-7µm) die straling
doorlaten = manueel, handarbeid
➔ Nog altijd kleurloos
➔ Nadien coupes monteren op draagglaasje
4. deparaffineren
- In xyleen/tolueen: lipiden lossen op
- Dan in dalende % alcohol in H2O
- Dan in waterige oplossing
➔ Nodig om te kunnen kleuren want kleuring is H2O-oplosbaar
-> alles in omgekeerde richting; parafine moet eruit
FFPE +:
- Volume biopt niet zo belangrijk
4
Wat is histologie?
• Lichaamsdelen zijn opgebouwd uit:
- Epitheel
- Bindweefsel
- Spier
- Zenuwweefsel
• Weefsels zijn opgebouwd uit:
- Cellen
- ECM
- Vloeistof (bloed, interstitieel vocht, lymfe)
• Histologie = studie vd gedetailleerde structuur van weefsels
• Histopathologie = identificatie van ziekteproces/achterhalen van diagnose dmv
weefselonderzoek
• Onderzoeksterrein: organisme – orgaanstelsel – orgaan – weefsel – cel – organel –
macromolecule – molecule
- Organisme + orgaanstelsel: ANATOMIE = met blote oog; 100µm – 10m
- Anderen: HISTOLOGIE = microscoop; 100nm – 10mm
- Bijzondere histologie = CYTOLOGIE; 0.1nm- 10µm
• Soorten microscopen: Lichtmicroscopie – elektronen microscopie
➔ Meestal met klassieke microscopie, soms met fluorescentie microscoop
➔ Stel werken met levende/delende cellen: andere microscoop nodig (zie verder)
Lichtmicroscoop
• Oplossend vermogen = minimale afstand tussen 2 punten om ze als afzonderlijke
punten te herkennen
- Bij menselijk oog op afstand van 25cm: 70µm
- Stel toch dichter bij elkaar en we willen ze kunnen onderscheiden -> microscopie:
bij lichtmicroscopie wordt het beeld over een grotere hoek op het netvlies
geprojecteerd door een lenzenstelsel: 0,2µm => 500x nauwkeuriger dan blote
oog
• 3 lenssystemen:
- Condensor: bundelt het licht, vergroot niet
- Objectief: beeldt het objectief af, vergroot wel
- Oculair: lens om het beeld met het oog waar te
kunnen nemen, vergroot wel, zit dichtst bij oog
- Diafragma: bepaalt hoeveel licht er binnen komt
• 5 belangrijke delen:
1
, Uiteindelijk preparaat wordt door zowel objectieven als oculair vergroot
➔ Oculair: 1 vaste vergroting, meestal x10
➔ Objectieven: in verschillende stappen object vergroten: varieert
tussen x25 en x1000
1. Lichtbron:
- halogeen lampje
- regelbare intensiteit
- spiegel stuurt licht richting object
- – grootte verlichte veld w geregeld dmv velddiafragma (iris)
- eventueel kleurfilter
2. Lens die licht bundelt en op preparaat projecteert
- Condensor
- Brandpunt instellen zodat rand diafragma precies ih vlak van het preparaat valt
- Verstelschroef om hoogte brandpunt condensor correct in te stellen
3. Objecttafel
- Plaat waarop licht vd condensator kan invallen
- Kruistafel met 2 schuifbare assen
4. Lenzen om beeld te vergroten
- Eindvergroting = vergroting objectief x vergroting oculair
- Objectieven = voorwerplenzen; vormt een vergroot beeld uit het
licht dat door preparaat valt
➔ Hoe groter de vergroting, hoe kleiner de afstand van objectief tem
preparaat
➔ Heeft bepaalde numerieke apertuur(NA= n . sinѲ); houdt verband
met max. hoek waarmee licht invalt; stel veel vergroting -> grote
hoek -> grote NA en dat getal staat op objectief
➔ 0.17 = correctiefactor voor dekglas dat weefsel beschermt
- Via prisma wordt beeld verder geleid door tubus
- Oculair = ooglens; vergroot beeld verder tot virtueel beeld
- Resolutie = scheidend vermogen = kleinste afstand waarmee 2 punten nog net
gescheiden w weergegeven
5. Mechaniek om lenzen op juiste afstand te brengen tot het object
- Macro -en microschroef
- Preparaat wordt precies ih brandpunt vd objectieven gebracht zodat object
scherp w afgebeeld
• (contrastmicroscopie: verhogen contrast in ongekleurde preparaten)
• Fluorescentiemicroscopie: lokaliseren + kwantificeren van fluorescerende moleculen
in cellen – detectie door uitzenden van bepaalde golflengte na absorptie van licht
Technieken voor lichtmicroscopie
A.Voorbereiding van weefsels
• Te onderzoeken materiaal geschikt maken voor microscopisch onderzoek
2
, - Cytologie = individuele cellen; cellen uit te strijken / postief: snel / negatief: heel
beperkt, cellen iets verderop in weefsel kunnen wel iets kwaadaardig hebben
- Histologie = cellen in weefselverband, verhouding van cellen; dunne sneetjes te
maken / meer invasief maar meer info
1.herkomst van verse weefsels of cellen
a) Chirurgische resectie: bv niet hele darm onder microscoop -> stukjes nemen om
vragen te beantwoorden: welke tumor, is tumor volledig uit lichaam?
b) Biopsie:
- endoscopisch biopt
- core needle biopt CNB: met holle naald in bepaald orgaan prikken -> cilinders
- punchbiopt: vaak door huisarts genomen
- excisiebiopsie: bedoeling curatief te zijn; letsel verwijderen + letselvrije zone
- incisiebiopsie: diagnostisch, en dan afhankelijk van diagnose w bepaald hoe breed
rondom letsel gaan snijden
c) afzonderlijke cellen:
- FNAC = fine needle aspiration; cytologie
- Bv bij tumor in borstkas met broncoscoop EBUS-> echo -> naald en cellen nemen;
stel niet voldoende; borstkas opensnijden
- Vocht
- Cervixbrush: tussen haartjes van borstel blijven cellen zitten
- Bloed/beenmerguitstrijkje
2.ontvangst en voorbereiding
* labelling + weefsel inkten, openknippen en spoelen
* macroscopie: insnijden van solide
organen en op uitzicht bekijken of er een
tumor is
* weefsels zijn te groot om onder de
microscoop te leggen
* rottingsproces voorkomen:
koelen/fixeren/vers in bep. Medium
steken + GF toevoegen zodat
tumorcellen groeien, dan celdeling
stilleggen en karyotype bepalen
3. fixatie
* bewaren architectuur vh weefsel
* weefsel in oorspronkelijke toestand bewaren/verteringsprocessen ‘autolyse’ voorkomen
* structuur biomoleculen wijzigen: stoppen van eiwitactiviteit + componenten op hun plaats
houden
3
, • Reversibel -> vriescoupe: SNAP FREEZING; -180°C; heel snel heel koud maken;
enzymatische activiteit + RNA en DNA behouden; bv tijdens een operatie
• Irreversibel: fixatief -> FFPE = Formalin-Fixed Paraffin-Embedded;
- Formaldehyde gebaseerd: formol: reageert met AZ; denatureert proteinen, is
toxisch
- Alcohol
- Formol + parafine is soort kaarsvet om weefsel zo fijn te kunnen snijden, is
belangrijkste omdat uitzicht daar het beste is, min 2 dagen wachten
• IMMERSIE/PERFUSIE
- Immersie: weefsel in pot met fixatievloeistof (1:2), pot goed sluiten: formol
penetreert weefsels met snelheid van 1 mm per uur. Ook niet te lang anders te
hard
- Perfusie: vb fixatie vd longen; inspuiten met formol om ook binnenkant weefsels
te fixeren
B.Procedure maken van PARAFFINECOUPES (FFPE)
* kleuren is nodig om chirurgisch snedevlak aan te tonen, anders weet je niet wat sneden
zijn van de patholoog en of de tumor wel of niet volledig verwijderd is uit het lichaam
1. macroscopie en versnijden: bot decalcifiëren met mierenzuur
- Kleuring zegt niet alles want kan ook zijn dat indivuele cellen die niet zichtbaar zijn
met blote oog wel dieper in weefsel al zitten
2. inbedden = doordrenken met materiaal van hoge en uniforme hardheid
- Dehydratatie; weefsel bestaat voor 90% uit vocht -> allemaal verwijderen door
alcohol anders dringt parafine niet door
- Klaring (= alcohol verwijderen dmv tolueen/xyleen)
- Paraffinering
- Uitbedden
3. coupes snijden met microtoom = vervaardigen van dunne coupes (5-7µm) die straling
doorlaten = manueel, handarbeid
➔ Nog altijd kleurloos
➔ Nadien coupes monteren op draagglaasje
4. deparaffineren
- In xyleen/tolueen: lipiden lossen op
- Dan in dalende % alcohol in H2O
- Dan in waterige oplossing
➔ Nodig om te kunnen kleuren want kleuring is H2O-oplosbaar
-> alles in omgekeerde richting; parafine moet eruit
FFPE +:
- Volume biopt niet zo belangrijk
4
