KLINISCHE BIOLOGIE
DIAGNOSTISCHE EN THERAPEUTISCHE METHODIEKEN
2. ANALYTISCHE TECHNIEKEN
2.1 FOTOMETRIE
Intensiteit
Fotometrie = standaardtechniek voor vele biochemische reacties.
𝐼 Eigenlijke wet:
Gebaseerd op wet van ‘Lambert-Beer’: 𝐸 = 2 − log(%𝑇) (met %𝑇 = 𝑋 100).
𝐼0 𝐸 = 𝜀×𝐶×𝑙
➔ De wet is enkel geldig als het gaat over licht met 1 bepaalde golflengte E = extinctie
𝜀 = molaire extinctiecoëfficiënt
Hoeveelheid geabsorbeerd licht levert informatie over de aanwezige concentratie.
C = concentratie
Gebruikt voor: l = cuvetlengte
- Meeste substraten (glucose, creatinine, ureum, calcium, ijzer, cholesterol…)
- Vrijwel alle enzymen (LDH, AST, ALT, CK, GGT, alkalische fosfatase, amylase…)
Er zit een ‘ruis’ op van 0,128 als men
water gebruikt t.o.v. een blanco:
=> Corrigeren door 0,128 af te trekken
,2.2 POTENTIOMETRIE
Elektrochemische methode die berust op de wet van Nernst
Aangewend voor meting van:
- Natrium
- Kalium
- Chloride
2 soorten:
1. Indirecte potentiometrie = op een verdund staal (in
centrale laboratoria)
2. Directie potentiometrie = op een niet verdund staal (in
point-of-care toestellen)
2.3 OSMOMETRIE
Osmolaliteit van serum of urine kan worden bepaald door de vriespuntdaling te meten:
→ osmolaliteit van 1000 mosm/kg komt overeen met een vriespuntsdaling van 1,86 °C.
2.4 ELEKTROFORESE
Aan de hand van het analyseren van het bewegen, onder invloed van een elektrisch veld, van macromoleculen
door een gel (meestal agarose gels), de groottes van de molecules t.o.v. elkaar beoordelen.
Gebruik:
a. Scheiden van eiwitten op basis van lengte
b. RBC-afwijkingen opsporen (bv. Sikkelcel) of HbA2 (merker voor beta-thalassemie) opsporen
c. + door toepassing van bijzondere kleuringen: enzymactiviteit aantonen
→ iso-enzymen met gelijkaardige activiteit, maar andere structuur opsporen
d. Capillaire elektroforese:
a. Geen gel, maar een haarfijn capillair
b. Zeer hoge spanningen
c. Indrukwekkende resoluties kunnen bereikt worden
d. (plasma-eiwitscheiding, dosage van farmaca en studie van eiwitheterogeniteit)
2
,2.5 IMMUNOLOGISCHE ASSAYS
Hierbij worden antilichamen (mono-/ polyklonaal) gebruikt als uiterst specifiek reagentia.
Gebruikt voor metingen van C-reactief proteïne, immuunglobulines en tal van andere serumeiwitten.
Soorten:
- Immunoturbidimetrie:
o Fotometer
- Immunonefelometrie:
o Nefelometer
o Ontstane strooilicht wordt gemeten met een optische detector die niet op de as van de
lichtbron staat → grotere analytische gevoeligheid
In beide wordt gebruik gemaakt van een reactie tussen toegevoegde antilichamen en het serum of plasma
aanwezige antigen, hierdoor ontstaat een kleine nevel van immuuncomplexen.
Speciale vorm: radio-immuno assay (RIA)
→ Hier kan men antigenen in zeer lage concentraties meten (tumoreiwitten, hormonen, vitamines..)
Tegenwoordig:
- ELISA = enzyme linked immunosorbent assay
→ I.p.v. isotoop, gebruikt men een enzym om het ligand te merken
- ECLIA = elektrochemiluminescentie immunoassay
→ Immuuncomplex wordt luminiscent gelabeled
ELISA-techniek
2.6 CHROMATOGRAFIE
Verschillende componenten langs een specifieke vaste stof laten lopen waaraan de ene component sterker
bindt dan de andere component(en).
Gebruik:
- Toxicologie: opsporen van farmaca en toxische substanties
- Monitoring van diabetes: HbA1c a.d.h.v. high-performance liquid chromatography (HPLC)
- Metabole aandoeningen: gaschromatografie gekoppeld aan massaspectometrie (GC-MS)
o Bv. Erfelijke aandoening van aminozuurstofwisseling opsporen:
→ GC-MS spectra van organische zuren bestuderen
3
, 2.7 HEMOCYTOMETRIE
= het tellen van het aantal cellen in het bloed
MANUELE MICROSCOPIE
Klassieke manier: telkamers en microscopen.
AUTOMATISCHE CELTELLER
Maken gebruik van de fysische eigenschappen van de verschillende soorten
bloedcellen:
1. Voorwaardse lichtverstrooiing: grootte afhankelijk
2. Zijwaardse lichtverstrooiing: granuliteitsafhankelijk
3. Fluorescentie: DNA/RNA-afhankelijk
Moderne aparatuur kan verdelen in 5 hoofdgroepen:
→ neutrofielen, eosinofielen, basofielen, lymfocyten en monocyten
Interfererende factoren: plaatjesaggregaten, grote bloedplaatjes + ernstige infectie of leukemie
4
DIAGNOSTISCHE EN THERAPEUTISCHE METHODIEKEN
2. ANALYTISCHE TECHNIEKEN
2.1 FOTOMETRIE
Intensiteit
Fotometrie = standaardtechniek voor vele biochemische reacties.
𝐼 Eigenlijke wet:
Gebaseerd op wet van ‘Lambert-Beer’: 𝐸 = 2 − log(%𝑇) (met %𝑇 = 𝑋 100).
𝐼0 𝐸 = 𝜀×𝐶×𝑙
➔ De wet is enkel geldig als het gaat over licht met 1 bepaalde golflengte E = extinctie
𝜀 = molaire extinctiecoëfficiënt
Hoeveelheid geabsorbeerd licht levert informatie over de aanwezige concentratie.
C = concentratie
Gebruikt voor: l = cuvetlengte
- Meeste substraten (glucose, creatinine, ureum, calcium, ijzer, cholesterol…)
- Vrijwel alle enzymen (LDH, AST, ALT, CK, GGT, alkalische fosfatase, amylase…)
Er zit een ‘ruis’ op van 0,128 als men
water gebruikt t.o.v. een blanco:
=> Corrigeren door 0,128 af te trekken
,2.2 POTENTIOMETRIE
Elektrochemische methode die berust op de wet van Nernst
Aangewend voor meting van:
- Natrium
- Kalium
- Chloride
2 soorten:
1. Indirecte potentiometrie = op een verdund staal (in
centrale laboratoria)
2. Directie potentiometrie = op een niet verdund staal (in
point-of-care toestellen)
2.3 OSMOMETRIE
Osmolaliteit van serum of urine kan worden bepaald door de vriespuntdaling te meten:
→ osmolaliteit van 1000 mosm/kg komt overeen met een vriespuntsdaling van 1,86 °C.
2.4 ELEKTROFORESE
Aan de hand van het analyseren van het bewegen, onder invloed van een elektrisch veld, van macromoleculen
door een gel (meestal agarose gels), de groottes van de molecules t.o.v. elkaar beoordelen.
Gebruik:
a. Scheiden van eiwitten op basis van lengte
b. RBC-afwijkingen opsporen (bv. Sikkelcel) of HbA2 (merker voor beta-thalassemie) opsporen
c. + door toepassing van bijzondere kleuringen: enzymactiviteit aantonen
→ iso-enzymen met gelijkaardige activiteit, maar andere structuur opsporen
d. Capillaire elektroforese:
a. Geen gel, maar een haarfijn capillair
b. Zeer hoge spanningen
c. Indrukwekkende resoluties kunnen bereikt worden
d. (plasma-eiwitscheiding, dosage van farmaca en studie van eiwitheterogeniteit)
2
,2.5 IMMUNOLOGISCHE ASSAYS
Hierbij worden antilichamen (mono-/ polyklonaal) gebruikt als uiterst specifiek reagentia.
Gebruikt voor metingen van C-reactief proteïne, immuunglobulines en tal van andere serumeiwitten.
Soorten:
- Immunoturbidimetrie:
o Fotometer
- Immunonefelometrie:
o Nefelometer
o Ontstane strooilicht wordt gemeten met een optische detector die niet op de as van de
lichtbron staat → grotere analytische gevoeligheid
In beide wordt gebruik gemaakt van een reactie tussen toegevoegde antilichamen en het serum of plasma
aanwezige antigen, hierdoor ontstaat een kleine nevel van immuuncomplexen.
Speciale vorm: radio-immuno assay (RIA)
→ Hier kan men antigenen in zeer lage concentraties meten (tumoreiwitten, hormonen, vitamines..)
Tegenwoordig:
- ELISA = enzyme linked immunosorbent assay
→ I.p.v. isotoop, gebruikt men een enzym om het ligand te merken
- ECLIA = elektrochemiluminescentie immunoassay
→ Immuuncomplex wordt luminiscent gelabeled
ELISA-techniek
2.6 CHROMATOGRAFIE
Verschillende componenten langs een specifieke vaste stof laten lopen waaraan de ene component sterker
bindt dan de andere component(en).
Gebruik:
- Toxicologie: opsporen van farmaca en toxische substanties
- Monitoring van diabetes: HbA1c a.d.h.v. high-performance liquid chromatography (HPLC)
- Metabole aandoeningen: gaschromatografie gekoppeld aan massaspectometrie (GC-MS)
o Bv. Erfelijke aandoening van aminozuurstofwisseling opsporen:
→ GC-MS spectra van organische zuren bestuderen
3
, 2.7 HEMOCYTOMETRIE
= het tellen van het aantal cellen in het bloed
MANUELE MICROSCOPIE
Klassieke manier: telkamers en microscopen.
AUTOMATISCHE CELTELLER
Maken gebruik van de fysische eigenschappen van de verschillende soorten
bloedcellen:
1. Voorwaardse lichtverstrooiing: grootte afhankelijk
2. Zijwaardse lichtverstrooiing: granuliteitsafhankelijk
3. Fluorescentie: DNA/RNA-afhankelijk
Moderne aparatuur kan verdelen in 5 hoofdgroepen:
→ neutrofielen, eosinofielen, basofielen, lymfocyten en monocyten
Interfererende factoren: plaatjesaggregaten, grote bloedplaatjes + ernstige infectie of leukemie
4
