lOMoARcPSD|12869796
Hoofdstuk 1: Inleiding +
technieken
1. Prepareren en observeren van cellen en weefsels
Doel
Cellen en weefsels zichtbaar maken voor LM en EM
Probleem
- Weinig licht en e- doorlatend
- Weinig contrast in biologisch materiaal
Oplossing
- Fixeren
- Inbedden
- Snijden
- Kleuren of contrasteren
-
Cellen
Stadia van celcultivering
- weefsel wordt enzymatisch behandelt
- cellen zakken uit/ naar bodem gecentrifugeerd
- cellen worden uitgeplaat in een groeirecipiënt
- Indien confluente laag van cellen: cellen losmaken en splitsen
Cultuurcondities
MEM (minimum essential medium) bevat:
- isotonische zouten
- energiebron (glucose)
- essentiële aminozuren en vitamines
- serum
Andere klassieke celmedia:
- DMEM
- M199
- McCoy’s
- RPMI1640
Culturen dienen te worden gegroeid onder een atmosfeer van 5% CO2 en een goede pH (7,4)
Cultuurrecipiënten
- gesloten flessen ( voor in warme kamer)
- open platen (voor in CO2 ovens)
- Rollerflessen voor in de warme kamer
- CO2 oven met cultuurplaten
1
, lOMoARcPSD|12869796
Oorsprong van cellen, cellijnen
cellen kunnen afkomstig zijn van:
- andere laboratoria
- eigen isolatie (primaire culturen)
- celbanken (bijvoorbeeld ATTC)
Groeisubstraten en -procedures
- is fysische drager, maar beschermt ook tegen anoïkis (= vorm van geprogrammeerde celdood of apoptose).
- Essentieel voor adherente celculturen (de meeste celtypes, maar niet nodig voor circulerende bloedcellen of
bepaalde tumorcellen).
- cellen op eiwit van extra cellulaire matrix laten groeien zodat in vitro ong gelijk is aan in vivo
Materie:
- glas (negatief geladen),
- voorbehandeld polystyreen (microplaten, flessen en multiplaten, rollers, beads)
- coatings zoals:
o poly-D-lysine (met sterk positieve lading),
o collageen (eiwit van de Extra-Cellulaire Matrix = E.C.M.),
o geconditioneerd milieu, eventueel continu gevormd door feeder celcultures, die bv. door beperkte
bestraling met gamma-stralen geïnhibeerd zijn voor celdeling maar niet voor celmetabolisme
cellen hebben soms signalen/stoffen nodig van omliggende cellen dus nabootsen: of medium vd
moedercultuur gebruiken of alleen op een feeder cellaag laten groeien
Doel:
- aspecifieke fysische interactie; toelaten van cellulaire adhesie en celspreiding (<-> anchorage-
independence)
- specifieke functionele interactie met onderliggende cellen en E.C.M. -> differentiatie-inductie door
stimulatie vanwege de ‘basaal membraan’ of basale lamina (= BM of Basement Membrane)
Celdensiteits-afhankelijke inhibitie
- cellen in cultuur delen tot ze een confluente 2D monolaag vormen, dan ‘contactinhibitie’ van cel proliferatie: o.a.
omwille van concurrentie voor mitogenen
- voeg vers medium toe delingen herbeginnen
- nog efficiënter: splits de cultuur in dochterculturen (trypsine-EDTA procedure)
Tumorcellen kunnen ook 3D groeien (in dense foci) dan hebben ze het vermogen van contactinhibitie verloren
in vivo omgeving nabootsen zowel boven als beneden
2
, lOMoARcPSD|12869796
Procedure van celtransfer
- gebeurt door eenvoudige verdunning bij suspensiecultures (eventueel na zacht afcentrifugeren en
heropname in vers milieu);
- bij adherente cellen gebeurt de celtransfer eens confluentie van de cel-(mono)-laag optreedt (gemiddeld
om de 3 à 7 dagen):
hiertoe wordt de culture behandeld met trypsine/EDTA (TE);
trypsine = maagprotease, dat bij een korte behandeling de oppervlakte-eiwitten van de
cellen degradeert;
EDTA (ethyleendiaminetetraäcetaat), cheleert calcium en magnesium, wat interfereert
met zowel intercellulaire adhesie als cel-substraat-binding.
In geschikte condities komen de cellen los van het substraat èn van elkaar, en vormen een
suspensie van levende opgebolde cellen. De suspensie is optimaal als ze monocellulair is (geen
meercellige aggregaten).
Deze wordt normaliter 1 over 3 (‘normale’ cellen) tot 1 over 30 (‘tumorale’ cellen) uitverdund
(uitgesplitst) en dan uitgezaaid in nieuwe recipiënten.
Resterend trypsine wordt geïnhibeerd door protease-inhibitoren (natuurlijk aanwezig in het
serum)
Stappen bij celadhesie en -spreiding
stappen bij celadhesie en -spreiding welke plaatsvinden na het losmaken en uitplaten vd cellen:
- de cellen zakken uit onder invloed van gravitatie
- ze maken dan initieel contact met het substraat (minimaal oppervlakte van adhesie daar de cellen nog opgebold
zijn)
- dan ondergaan ze in de eerstvolgende uren een proces van progressieve spreiding over het substraat (vraagt
energie en cytoskelet-wijzigingen; leidt tot vergroting van celcontact- oppervlakte en versterking van de cel-
substraatsadhesie);
- tenslotte gaan ze een sterke binding aan met het substraat,
doordat ze dit laatste modifiëren met eigen aangemaakte E.C.M. moleculen.
Ondanks deze sterke cel-substraatsadhesie kan een cel doorgaans (traag
maar zeker) migreren over het celoppervlak.
Hiertoe wordt focaal en tijdelijk de celadhesie geïnhibeerd (waar de cel loskomt) en elders de
celadhesie opgebouwd (in de richting van de celmigratie)
Speciale apparatuur voor de celcultuur van vertebraten
- laminaire flowbench (fase contrast) + steriliserende HEPA (high efficiency Particulate air) filter
- CO2 oven + steriliserende HEPA filter
- stockering van ingevroren cellen in vloeibare stikstof
differentiatie in vitro spontaan van myoblast naar myotube
3
, lOMoARcPSD|12869796
Stamcellen
stamcel blijft maar delen, maar we kunnen ze sturen naar verschillende cellen (differentiëren)
totipotent: je zou een hele embryo kunnen maken
pluripotent: je kan er alle soorten cellen uit krijgen maar geen embryo meer
multipotent: bloedstamcellen kunnen alle soorten bloedcellen maken maar geen levercellen
IPSCs: geïnduceerde pluripotente stamcellen
Kwaliteitscontrole
Contaminatie met micro-organismen
- probleem omwille van hun snelle groei in de rijke groeimilieus; omvatten bacteriën, gisten, schimmels en vooral
antibiotica-resistente mycoplasma’s (PPLO, pleuropneumonia-like organisms); deze laatste zijn parasitair, ten dele
intracellulair, verstoren het cellulair metabolisme (vaak vermoedbaar door overdreven verzuring van milieu), en
zijn moeilijk detecteerbaar (cytoplasmatische DNA-kleuring, ELISA, PCR-detectie) en vaak nog moeilijker
elimineerbaar.
Contaminatie met vreemde cellen
- meer verspreid dan algemeen onderkend of toegegeven; de helft van de “oudere” cellijnen zijn varianten van
HeLa, een “klassieke” cellijn afgeleid van een humane cervix-tumor (van Mevr. Helen La.); vele “menselijke”
cellijnen bleken eigenlijk van muis of rat afkomstig te zijn; detectie van dergelijke contaminaties is mogelijk door
o.a. genetische fingerprinting en karyotypering (zie verder).
De (genetische) zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van een celcultuur kan bv. gemeten worden door karyotypering,
waarbij aantal en vorm van de chromosomen in individuele cellen worden bepaald
2. Lichtmicroscoop
Overzicht
Resolutie = 200nm
- = afstand waarbij je 2 punten nog kunt onderscheiden
- Bepaald door het objectief en de golflengte van het zichtbare licht
Resolutie afhankelijk van preparaat:
- Gefixeerd en gekleurd -> klaarveldmicroscopie
- Levend ->speciale microscopie
Celculturen op dekglaasjes worden behandeld in toto:
- Dikker materiaal wordt versneden
o Secties na fixatie en inbedding in paraffine
o Cryosecties van bevroren materiaal en dan fixatie
- Analyse via een speciale microscoop
Klassieke LM = klaarveldmicroscoop
- Preparaten worden bekeken ahv doorvallend wit licht
- condensor bundelt het doorvallende licht op het preparaat bepaalt samen met het objectief
4
Hoofdstuk 1: Inleiding +
technieken
1. Prepareren en observeren van cellen en weefsels
Doel
Cellen en weefsels zichtbaar maken voor LM en EM
Probleem
- Weinig licht en e- doorlatend
- Weinig contrast in biologisch materiaal
Oplossing
- Fixeren
- Inbedden
- Snijden
- Kleuren of contrasteren
-
Cellen
Stadia van celcultivering
- weefsel wordt enzymatisch behandelt
- cellen zakken uit/ naar bodem gecentrifugeerd
- cellen worden uitgeplaat in een groeirecipiënt
- Indien confluente laag van cellen: cellen losmaken en splitsen
Cultuurcondities
MEM (minimum essential medium) bevat:
- isotonische zouten
- energiebron (glucose)
- essentiële aminozuren en vitamines
- serum
Andere klassieke celmedia:
- DMEM
- M199
- McCoy’s
- RPMI1640
Culturen dienen te worden gegroeid onder een atmosfeer van 5% CO2 en een goede pH (7,4)
Cultuurrecipiënten
- gesloten flessen ( voor in warme kamer)
- open platen (voor in CO2 ovens)
- Rollerflessen voor in de warme kamer
- CO2 oven met cultuurplaten
1
, lOMoARcPSD|12869796
Oorsprong van cellen, cellijnen
cellen kunnen afkomstig zijn van:
- andere laboratoria
- eigen isolatie (primaire culturen)
- celbanken (bijvoorbeeld ATTC)
Groeisubstraten en -procedures
- is fysische drager, maar beschermt ook tegen anoïkis (= vorm van geprogrammeerde celdood of apoptose).
- Essentieel voor adherente celculturen (de meeste celtypes, maar niet nodig voor circulerende bloedcellen of
bepaalde tumorcellen).
- cellen op eiwit van extra cellulaire matrix laten groeien zodat in vitro ong gelijk is aan in vivo
Materie:
- glas (negatief geladen),
- voorbehandeld polystyreen (microplaten, flessen en multiplaten, rollers, beads)
- coatings zoals:
o poly-D-lysine (met sterk positieve lading),
o collageen (eiwit van de Extra-Cellulaire Matrix = E.C.M.),
o geconditioneerd milieu, eventueel continu gevormd door feeder celcultures, die bv. door beperkte
bestraling met gamma-stralen geïnhibeerd zijn voor celdeling maar niet voor celmetabolisme
cellen hebben soms signalen/stoffen nodig van omliggende cellen dus nabootsen: of medium vd
moedercultuur gebruiken of alleen op een feeder cellaag laten groeien
Doel:
- aspecifieke fysische interactie; toelaten van cellulaire adhesie en celspreiding (<-> anchorage-
independence)
- specifieke functionele interactie met onderliggende cellen en E.C.M. -> differentiatie-inductie door
stimulatie vanwege de ‘basaal membraan’ of basale lamina (= BM of Basement Membrane)
Celdensiteits-afhankelijke inhibitie
- cellen in cultuur delen tot ze een confluente 2D monolaag vormen, dan ‘contactinhibitie’ van cel proliferatie: o.a.
omwille van concurrentie voor mitogenen
- voeg vers medium toe delingen herbeginnen
- nog efficiënter: splits de cultuur in dochterculturen (trypsine-EDTA procedure)
Tumorcellen kunnen ook 3D groeien (in dense foci) dan hebben ze het vermogen van contactinhibitie verloren
in vivo omgeving nabootsen zowel boven als beneden
2
, lOMoARcPSD|12869796
Procedure van celtransfer
- gebeurt door eenvoudige verdunning bij suspensiecultures (eventueel na zacht afcentrifugeren en
heropname in vers milieu);
- bij adherente cellen gebeurt de celtransfer eens confluentie van de cel-(mono)-laag optreedt (gemiddeld
om de 3 à 7 dagen):
hiertoe wordt de culture behandeld met trypsine/EDTA (TE);
trypsine = maagprotease, dat bij een korte behandeling de oppervlakte-eiwitten van de
cellen degradeert;
EDTA (ethyleendiaminetetraäcetaat), cheleert calcium en magnesium, wat interfereert
met zowel intercellulaire adhesie als cel-substraat-binding.
In geschikte condities komen de cellen los van het substraat èn van elkaar, en vormen een
suspensie van levende opgebolde cellen. De suspensie is optimaal als ze monocellulair is (geen
meercellige aggregaten).
Deze wordt normaliter 1 over 3 (‘normale’ cellen) tot 1 over 30 (‘tumorale’ cellen) uitverdund
(uitgesplitst) en dan uitgezaaid in nieuwe recipiënten.
Resterend trypsine wordt geïnhibeerd door protease-inhibitoren (natuurlijk aanwezig in het
serum)
Stappen bij celadhesie en -spreiding
stappen bij celadhesie en -spreiding welke plaatsvinden na het losmaken en uitplaten vd cellen:
- de cellen zakken uit onder invloed van gravitatie
- ze maken dan initieel contact met het substraat (minimaal oppervlakte van adhesie daar de cellen nog opgebold
zijn)
- dan ondergaan ze in de eerstvolgende uren een proces van progressieve spreiding over het substraat (vraagt
energie en cytoskelet-wijzigingen; leidt tot vergroting van celcontact- oppervlakte en versterking van de cel-
substraatsadhesie);
- tenslotte gaan ze een sterke binding aan met het substraat,
doordat ze dit laatste modifiëren met eigen aangemaakte E.C.M. moleculen.
Ondanks deze sterke cel-substraatsadhesie kan een cel doorgaans (traag
maar zeker) migreren over het celoppervlak.
Hiertoe wordt focaal en tijdelijk de celadhesie geïnhibeerd (waar de cel loskomt) en elders de
celadhesie opgebouwd (in de richting van de celmigratie)
Speciale apparatuur voor de celcultuur van vertebraten
- laminaire flowbench (fase contrast) + steriliserende HEPA (high efficiency Particulate air) filter
- CO2 oven + steriliserende HEPA filter
- stockering van ingevroren cellen in vloeibare stikstof
differentiatie in vitro spontaan van myoblast naar myotube
3
, lOMoARcPSD|12869796
Stamcellen
stamcel blijft maar delen, maar we kunnen ze sturen naar verschillende cellen (differentiëren)
totipotent: je zou een hele embryo kunnen maken
pluripotent: je kan er alle soorten cellen uit krijgen maar geen embryo meer
multipotent: bloedstamcellen kunnen alle soorten bloedcellen maken maar geen levercellen
IPSCs: geïnduceerde pluripotente stamcellen
Kwaliteitscontrole
Contaminatie met micro-organismen
- probleem omwille van hun snelle groei in de rijke groeimilieus; omvatten bacteriën, gisten, schimmels en vooral
antibiotica-resistente mycoplasma’s (PPLO, pleuropneumonia-like organisms); deze laatste zijn parasitair, ten dele
intracellulair, verstoren het cellulair metabolisme (vaak vermoedbaar door overdreven verzuring van milieu), en
zijn moeilijk detecteerbaar (cytoplasmatische DNA-kleuring, ELISA, PCR-detectie) en vaak nog moeilijker
elimineerbaar.
Contaminatie met vreemde cellen
- meer verspreid dan algemeen onderkend of toegegeven; de helft van de “oudere” cellijnen zijn varianten van
HeLa, een “klassieke” cellijn afgeleid van een humane cervix-tumor (van Mevr. Helen La.); vele “menselijke”
cellijnen bleken eigenlijk van muis of rat afkomstig te zijn; detectie van dergelijke contaminaties is mogelijk door
o.a. genetische fingerprinting en karyotypering (zie verder).
De (genetische) zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van een celcultuur kan bv. gemeten worden door karyotypering,
waarbij aantal en vorm van de chromosomen in individuele cellen worden bepaald
2. Lichtmicroscoop
Overzicht
Resolutie = 200nm
- = afstand waarbij je 2 punten nog kunt onderscheiden
- Bepaald door het objectief en de golflengte van het zichtbare licht
Resolutie afhankelijk van preparaat:
- Gefixeerd en gekleurd -> klaarveldmicroscopie
- Levend ->speciale microscopie
Celculturen op dekglaasjes worden behandeld in toto:
- Dikker materiaal wordt versneden
o Secties na fixatie en inbedding in paraffine
o Cryosecties van bevroren materiaal en dan fixatie
- Analyse via een speciale microscoop
Klassieke LM = klaarveldmicroscoop
- Preparaten worden bekeken ahv doorvallend wit licht
- condensor bundelt het doorvallende licht op het preparaat bepaalt samen met het objectief
4
