Diffractie 2 golflengten die langs een barrière passeren zich rond deze barrière
uitspreiden. Hoe kleiner de spleet van de barrière, hoe sterker de afbuiging.
Dispersie Breking die afhankelijk is van de golflengte. Maximaal voor blauw licht en
minimaal voor rood licht omdat dit minder gevoelig is voor breking.
Interferentie 2 golven kunnen met elkaar interfereren. De 2 uiteinden van een spleet zijn
2 individuele punten waaruit 2 nieuwe golven vertrekken die elkaar kunnen
beïnvloeden.
Constructieve interferentie: max. en min. vallen niet samen -> versterking
Conjugate vlakken Vlakken waarin hetzelfde punt kan worden waargenomen
Beelvormend pad en belichtingsvormend pad hebben conjugate vlakken. Dit
zijn de beeldpaden volgens de Köhler belichting.
Dark field Enkel licht visualiseren dat schuin wordt ingestuurd, geen centraal licht.
microscopie Faseobjecten gebruiken die het licht gaan breken en waarbij het licht valt
binnen de detectiecapaciteit (NA) van het objectief.
Fasecontrast -> licht laten invallen als een conus op het object
microscopie -> normaal krijg je een helderbeeld waar al het licht wordt doorgelaten
-> wanneer je het gebroken licht selectief vertraagd met ¼x de golflengte
gaat het interfereren met het niet gebroken licht
-> gebroken licht valt in naast de faseplaatjes -> extra vertraging
-> faseverandering omzetten in intensiteitsverschillen -> licht capteren door
objectief
Band pass filter Filter die een beperkte band golflengtes van het zichtbare licht zullen
doorlaten (long en short pass filter)
Broad band cube Grootste signaal voor kleurstof geven gebaseerd op excitatie en
emissispectrum. Deze filter cube wordt gebruikt wanneer crosstalk niet
belangrijk is.
Narrow band cube Filter cube die wordt gebruikt wanneer de locatie van verschillende
fluoroforen in een sample belangrijk is.
Beam scanning Beam wordt gescand langs het specimen volgens rasters. 1 punt belichten
en detecteren.
Stage scanning Scanning waarbij wordt gescand in de x,y en z richting en waarbij de laser
wordt gefixeerd in 1 punt.
Singlet state Alle elektronen in de molecule hebben gepaarde spins. Deze elektronen
kunnen terugkeren naar de grondtoestand en daarbij licht uitzenden.
Triplet state 1 set elektronenspins is niet gepaard. De triplet state is de verboden staat.
Soms kan een triplet state molecule de grondtoestand bereiken zonder
daarbij licht uit te zenden. Wanneer er toch licht wordt uitgezonden gebeurt
dit door fosforescentie. Moleculen in triplet state kunnen zorgen voor
fototoxiciteit en fotobleaching.
FRAP Fluorescense recovery after photobleaching. Hier wordt fotobleaching
gebruikt om de mobiliteit van moleculen in cellen na te gaan. Eerst wordt de
hele cel aangekleurd met GFP. Dan wordt een regio gefotobleached en
wordt gekeken hoe snel de fluorescentie zich hier zal herstellen door diffusie
en mobiliteit. Unbleached moleculen migreren naar bleached moleculen.
FLIP Fluorescense loss in photobleaching. Hier wordt fotobleaching gebruikt om
de mobiliteit van moleculen in cellen na te gaan. Een deel van een molecule
wordt gefotobleached, kijken hoe lang het duurt tot de fluorescentie
volledig is verdwenen. Wordt gebruikt om de connectiviteit na te gaan van
structuren in een cel.
PAGFP Nadeel bij FLIP en FLAP is dat er gefotobleached moet worden. Bij PAGFP
wordt GFP donker gehouden en geactiveerd door een UV puls.
, Voordeel: sterker fluorescent signaal
Nadeel: UV licht beschadigd het DNA en je hebt een initieel donkere cel dus
je moet zoeken naar wat je wil activeren in de cel.
Fotoconversie Van de ene fluorescente molecule overschakelen naar de andere
fluorescente molecule. Bv. Groene fluorescente molecule gebruiken, de cel
is groen aangekleurd -> UV licht gebruiken als conversiepuls -> nieuwe
fluorescente kleur rood.
Toepassingen: dynamiek van individuele mitochondriën, dynamiek van
moleculen bestuderen
FLAP Fluorescense localisation after photobleaching. Lost het probleem op bij
FLIP en FLAP waar de moleculen niet op dezelfde tijd kunnen worden
gelocaliseerd. Molecule waar men in geïnteresseerd is krijgt 2 labels:
-> fluorescent label
-> referentie label
FLAP signaal = bleached signaal – unbleached signaal
Toepassing: tracken van het gelabelde molecule
FRET Förster resonance transfer. Wordt gebruikt om de moleculaire interactie de
detecteren. Hierbij moeten 2 moleculen met een verschillend spectrum
dicht bij elkaar gelegen zijn. Het excitatiespectrum van de acceptor moet
overlappen met het emissiespectrum van de donor.
Voorbeelden om FRET tot expressie te brengen:
1. sensitized emission: detectie van acceptor signaal door emissie
-> intensiteit van acceptorfluorescentie wordt geregistreerd bij excitatie met
golflengte die optimaal is bij de donor fluorescente proteïne.
2. acceptor photobleaching: donor signaal neemt toe na acceptor bleaching
-> acceptor kn geen energie meer opnamen -> signaal van donor wordt
volledig vertaald in fluorescentie
3. FLIM: fluorescence lifetime imaging microscopie
-> lifetime van donor wordt korter: als linker tussen AZ korter wordt, als
FRET toeneemt
-> acceptor zorgt voor energieoverdracht, donor verliest aangeslagen
energie sneller in aanwezigheid van acceptor
Detector gain Sensitiviteit van de detector verhogen om een helderder beeld te vormen,
verhoogd het background signaal. Nadeel: ruis
Detector offset Pixels met een lage intensiteit worden onderdrukt, lage signalen kunnen
hierdoor verloren gaan.
Pinhole size Bepaalde dikte van optische coupe en z-resolutie. Dikke optische coupe, lage
z-resolutie. Lage pinhole size, weinig licht kan passeren -> minder intens
beeld, betere z-resolutie
Pixel array Hoeveelheid pixels in een beeld. Effect op kwaliteit van het beeld. Kleine
array, slechte resolutie, snelle scantijd, klein beeld.
Spectrale detector Fijnmazige detector. Spectrum opdelen in kleine bandjes, scheiden van
fluorescentie emissielicht in verschillende golflengtes. Vorm van
emissiespectrum waarnemen en overlappende spectra uit elkaar halen.
Near field Uitdeinend licht vervalt exponentieel binnen een afstand die kleiner is dan
microscopie de golflengte van het licht. Manier om de resolutie te verbeteren
NSOM = near field scanning optical microscopy
-> lichtprobe dichtbij het object brengen, samples met kleine physical
apertuur
uitspreiden. Hoe kleiner de spleet van de barrière, hoe sterker de afbuiging.
Dispersie Breking die afhankelijk is van de golflengte. Maximaal voor blauw licht en
minimaal voor rood licht omdat dit minder gevoelig is voor breking.
Interferentie 2 golven kunnen met elkaar interfereren. De 2 uiteinden van een spleet zijn
2 individuele punten waaruit 2 nieuwe golven vertrekken die elkaar kunnen
beïnvloeden.
Constructieve interferentie: max. en min. vallen niet samen -> versterking
Conjugate vlakken Vlakken waarin hetzelfde punt kan worden waargenomen
Beelvormend pad en belichtingsvormend pad hebben conjugate vlakken. Dit
zijn de beeldpaden volgens de Köhler belichting.
Dark field Enkel licht visualiseren dat schuin wordt ingestuurd, geen centraal licht.
microscopie Faseobjecten gebruiken die het licht gaan breken en waarbij het licht valt
binnen de detectiecapaciteit (NA) van het objectief.
Fasecontrast -> licht laten invallen als een conus op het object
microscopie -> normaal krijg je een helderbeeld waar al het licht wordt doorgelaten
-> wanneer je het gebroken licht selectief vertraagd met ¼x de golflengte
gaat het interfereren met het niet gebroken licht
-> gebroken licht valt in naast de faseplaatjes -> extra vertraging
-> faseverandering omzetten in intensiteitsverschillen -> licht capteren door
objectief
Band pass filter Filter die een beperkte band golflengtes van het zichtbare licht zullen
doorlaten (long en short pass filter)
Broad band cube Grootste signaal voor kleurstof geven gebaseerd op excitatie en
emissispectrum. Deze filter cube wordt gebruikt wanneer crosstalk niet
belangrijk is.
Narrow band cube Filter cube die wordt gebruikt wanneer de locatie van verschillende
fluoroforen in een sample belangrijk is.
Beam scanning Beam wordt gescand langs het specimen volgens rasters. 1 punt belichten
en detecteren.
Stage scanning Scanning waarbij wordt gescand in de x,y en z richting en waarbij de laser
wordt gefixeerd in 1 punt.
Singlet state Alle elektronen in de molecule hebben gepaarde spins. Deze elektronen
kunnen terugkeren naar de grondtoestand en daarbij licht uitzenden.
Triplet state 1 set elektronenspins is niet gepaard. De triplet state is de verboden staat.
Soms kan een triplet state molecule de grondtoestand bereiken zonder
daarbij licht uit te zenden. Wanneer er toch licht wordt uitgezonden gebeurt
dit door fosforescentie. Moleculen in triplet state kunnen zorgen voor
fototoxiciteit en fotobleaching.
FRAP Fluorescense recovery after photobleaching. Hier wordt fotobleaching
gebruikt om de mobiliteit van moleculen in cellen na te gaan. Eerst wordt de
hele cel aangekleurd met GFP. Dan wordt een regio gefotobleached en
wordt gekeken hoe snel de fluorescentie zich hier zal herstellen door diffusie
en mobiliteit. Unbleached moleculen migreren naar bleached moleculen.
FLIP Fluorescense loss in photobleaching. Hier wordt fotobleaching gebruikt om
de mobiliteit van moleculen in cellen na te gaan. Een deel van een molecule
wordt gefotobleached, kijken hoe lang het duurt tot de fluorescentie
volledig is verdwenen. Wordt gebruikt om de connectiviteit na te gaan van
structuren in een cel.
PAGFP Nadeel bij FLIP en FLAP is dat er gefotobleached moet worden. Bij PAGFP
wordt GFP donker gehouden en geactiveerd door een UV puls.
, Voordeel: sterker fluorescent signaal
Nadeel: UV licht beschadigd het DNA en je hebt een initieel donkere cel dus
je moet zoeken naar wat je wil activeren in de cel.
Fotoconversie Van de ene fluorescente molecule overschakelen naar de andere
fluorescente molecule. Bv. Groene fluorescente molecule gebruiken, de cel
is groen aangekleurd -> UV licht gebruiken als conversiepuls -> nieuwe
fluorescente kleur rood.
Toepassingen: dynamiek van individuele mitochondriën, dynamiek van
moleculen bestuderen
FLAP Fluorescense localisation after photobleaching. Lost het probleem op bij
FLIP en FLAP waar de moleculen niet op dezelfde tijd kunnen worden
gelocaliseerd. Molecule waar men in geïnteresseerd is krijgt 2 labels:
-> fluorescent label
-> referentie label
FLAP signaal = bleached signaal – unbleached signaal
Toepassing: tracken van het gelabelde molecule
FRET Förster resonance transfer. Wordt gebruikt om de moleculaire interactie de
detecteren. Hierbij moeten 2 moleculen met een verschillend spectrum
dicht bij elkaar gelegen zijn. Het excitatiespectrum van de acceptor moet
overlappen met het emissiespectrum van de donor.
Voorbeelden om FRET tot expressie te brengen:
1. sensitized emission: detectie van acceptor signaal door emissie
-> intensiteit van acceptorfluorescentie wordt geregistreerd bij excitatie met
golflengte die optimaal is bij de donor fluorescente proteïne.
2. acceptor photobleaching: donor signaal neemt toe na acceptor bleaching
-> acceptor kn geen energie meer opnamen -> signaal van donor wordt
volledig vertaald in fluorescentie
3. FLIM: fluorescence lifetime imaging microscopie
-> lifetime van donor wordt korter: als linker tussen AZ korter wordt, als
FRET toeneemt
-> acceptor zorgt voor energieoverdracht, donor verliest aangeslagen
energie sneller in aanwezigheid van acceptor
Detector gain Sensitiviteit van de detector verhogen om een helderder beeld te vormen,
verhoogd het background signaal. Nadeel: ruis
Detector offset Pixels met een lage intensiteit worden onderdrukt, lage signalen kunnen
hierdoor verloren gaan.
Pinhole size Bepaalde dikte van optische coupe en z-resolutie. Dikke optische coupe, lage
z-resolutie. Lage pinhole size, weinig licht kan passeren -> minder intens
beeld, betere z-resolutie
Pixel array Hoeveelheid pixels in een beeld. Effect op kwaliteit van het beeld. Kleine
array, slechte resolutie, snelle scantijd, klein beeld.
Spectrale detector Fijnmazige detector. Spectrum opdelen in kleine bandjes, scheiden van
fluorescentie emissielicht in verschillende golflengtes. Vorm van
emissiespectrum waarnemen en overlappende spectra uit elkaar halen.
Near field Uitdeinend licht vervalt exponentieel binnen een afstand die kleiner is dan
microscopie de golflengte van het licht. Manier om de resolutie te verbeteren
NSOM = near field scanning optical microscopy
-> lichtprobe dichtbij het object brengen, samples met kleine physical
apertuur
