Samenvatting Virologie farmacie (Ko7B4A)

Virologie
H1: ALGEMENE ASPECTEN VAN VIRUS INFECTIES EN HUN BEHANDELING
Morfologie
- Virus = kleinst gekend infectieus deeltje.
- Obligate intracellulaire parasieten, die niet autonoom kunnen vermenigvuldigen.
o Bij dieren, planten, bacteriën en schimmels.
- Kweek virus vereist levend substraat
o Celcultuur
o Bebroede kippeneieren
o Proefdier
- Species specificiteit.

Microscopie en cytopathogeen effect
- Diameter < 1µm: elektronenmicroscoop.
- Cytopathogeen effect (CPE) = vernietiging van gastheercellen door virusreplicatie.
o Virus: bij replicatie in geschikte celcultuur  wijziging in celmorfologie (cellysis)
 Lichtmicroscopisch.

Opbouw viruspartikels = virions
- Bevat DNA, omgeven door EW-mantel of capside = nucleocapside, hierrond soms lipide
buitenlaag = enveloppe. (naakt virus = geen evenloppe)
o Viraal genoom:
 RNA of DNA
 Aantal gecodeerde EW: 2-2500
 Compact genoom: overlappende genen of alternatieve splicing (TxN
tot pre-mRNAs die op verschillende wijzen gespliced worden).
o Capside
 = viraal gecodeerd proteïnestructuur, uit repetitieve eenheden (capsomeren)
 Nucleocapside: icosahedraal (20-vlak + 12 hoekpunten + 30 zijden), helicaal
of complexe vorm.
o Enveloppe
 Uit lipide-dubbellaag, afkomstig van celmembraan.
 Verwerpen: einde replicatie als ze cel verlaten door budding = knopvorming.
o Peplomeren of spikes
 = glycoproteïne-uitsteeksels in eveloppe.
 Capside-EW en peplomeer-EW
 Structureel
 Immunologisch: antigenen waartegen gastheer immuniteit maakt.

,Virus transmissie en pathogenese
Transmissieroutes
- Faeco-oraal: drinkwater besmet met fecaal afval of slechte handhygiëne.
- Respiratoir: droplet.
-
- Rechtstreeks contact met huid, speeksel of urine.
- Seksueel.
- Parenteraal: via besmet bloed.
- Verticaal: van moeder op kind (horizontaal = van 1 individu op een ander)
o Prenataal: transplacentaire passage
o Perinataal: besmetting thv geboortekanaal
o Postnataal: moedermelk of speekselcontact
- Zoönotisch: besmet dier
o Door gewerveld dier, met of zonder tussenkomst van insect.

Bepaald door stabiliteit virus buiten gastheer
- Niet geënveloppeerde virus: makkelijk overleven in buitenwereld.
- Geënveloppeerd virus: gevoelig voor uitdroging, extreme T of extreme pH.

Efficiëntie van verspreiding
Basis-reproductiegetal R0
= hoeveel personen gemiddeld secundair besmet door één primair besmet persoon.

Incubatietijd
= tijd tussen blootstelling aan virus en ziektesymptomen
- Zeer kort: 1-2 dagen
- Intermediair: 1-2 weken
- Zeer lang: 1-2 maanden

Ziektebeloop in de tijd
- Acute infectie: virus  lysis geïnfecteerde cellen. (influenza)
- Latente infectie: virus na 1e contact verborgen aanwezig in lichaam, geen replicatie. Virus
hieruit reactiveren tijden periodes van verminderde immuniteit.
- Chronisch persistente infectie: langdurige lage-graad virusreplicatie, waarbij drager continu
besmettelijk is.
- Deel asymptomatisch.
- Oncogeen virus: gastheercel transformeren tot continu delende cellen  kwaadaardig tumor

Immuniteit gastheer
Overleving binnen gastheer garanderen  immune-evasion mechanismen  natuurlijke of
adaptieve immuunrespons gastheer omzeilen.
- Natieve immuniteit omzeilen (overleven in maagzuur dat een naak virus is)
- Adaptieve immuniteit omzeilen (HIV onderdrukt CD4-lymfocyten)
- Verschillende virus subtypes of uitgesproken antigenische variabiliteit.

,Latentie = niet besmettelijke fase, zit in je lichaam maar niet actief.
Persistentie = altijd beetje besmettelijk, blijft maar in lage replicatie.




Laboratoriumdiagnostiek bij virus infecties
Opsporen virus of virus-specifieke antistoffen.
1. Virologische technieken
o Specimen: speeksel, feces, bloed
 Indirect: viruskweek
 In vitro = celcultuur
 In ovo = op bebroede kippeneieren
 In vivo = pasgeboren muizen
 Direct: PCR
2. Serologische technieken
o Voordeel: sneller en antistoffen aantonen nadat virus al verdwenen is
o Nadeel: serumpaar nodig voor aantonen stijging IgG antistoftier bij actuele infectie
OF IgM specifieke test: aantonen

Geïnfecteerd persoon: seronegatief  seropositief = seroconversie.
Tijdens covalescentie (herstelperiode): antistoftiter erg hoog, daarna dalen.

Microscopische technieken
- Lichtmicroscopie: o.b.v. virus-karakteristieke CPE.
- Fluorescentie: kleuring met fluorescent gemerkt antilichaam. (direct-indirect)
- Elektronenmicroscopie: opsporen moeilijk te kweken virussen.

Aantonen virale nucleïnezuren
= met specifieke primers of probers (sequenties complementair aan virale DNA of RNA sequenties.

In situ hybridisatie: detectie DNA of RNA in aangetast weefsel.
- Opsporen + lokalisatie virus.
- Weefselcoupe fixeren  behandelen met proteïnase  hybridisatie met probe  detectie
met enzym-gekoppeld antilichaam  enzymreactie met substraat  kleurreactie thv virus-
positieve cellen  microscopie evaluatie.

PCR = DNA virus en RT-PCR = RNA virus (reverse transcriptase) opsporen
= genetisch materiaal virus geamplificeerd iav twee specifieke primers
- Voordeel: gevoelig, specifiek en indien qPCR kwantitatief.
- Nadeel: duur, contaminatie en PCR inhiberende bestanddelen
- Gevoeligheid verhogen: nested-PCR = DNA eerst geamplificeerd met 1e primerset en daarna
2e primerset die een amplicon afbakent dat gelegen is binnen het eerste amplicon.
- Real time PCR: aantal DNA of RNA kopijen precies bepalen
A. Basisprincipe PCR test
o Staal + buffer + 4 deoxynucleoside-trifosfaten + enzym (hitte stabile Taq DNA
polymerase) + 2 primers.

, o PCR-apparaat met T-programma
1. 2 min 95°C = initiële denaturatie DNA
2. 40 cycli uit 30 sec bij 94°C = denaturatie DNA, 45 sec bij 60°C = hybridisatie
primers aan doelwit DNA en 60 sec bij 72°C = DNA extensie vanaf primers.
3. 5 min bij 72°C = finale extensie onafgewerkte DNA stukken
 Veel kopijen van amplicon = stukje DNA afgebakend door 2 primers.
o Staal bevat RNA: RT voor PCR.
B. Principe van real-time PCR
o Conventionele PCR: PCR gedurende 35-40 cycli herhaald.
 Analyse d.m.v. gelelektroforese + gel ethidiumbromide  DNA bandje onder
UV waarnemen.
 Niet kwantitatief: detectie op eindpunt
 Intensiteit bandjes: veel of weinig DNA aanwezig.
o Kwantitatieve PCR
 PCR reactie in tijd gevolgd: toename fluorescentie ifv
aantal PCR cycli.
 Bij stalen met initieel veel DNA: curve sneller opkomen
 aantal amplificatiecylci nodig om drempelwaarde in
fluorescentie te bereiken lager.
 Aantal DNA kopijen bij aanvang uit cycle threshold =
cyclusgetal waarbij de fluorescentie stijgt boven een
drempelwaarde.
 Standaardcurve voor absolute kwantificatie standaard = DNA-plasmide met
amplicon sequentie.
o Fluorescentie
 DNA intercalerende fluorescerende stof: naarmate DNA geamplificeerd
wordt  meer DNA-intercalator ingebouwd + fluorescentie stijgt.
 Taqman techniek: DNA probe toevoegen die gemerkt is met reporter en
quencher molecule (probe aan DNA  geen fluorescentie want quencher
dooft reporter).
 PCR: probe van DNA verdreven door polymerase, exonuclease
activiteit  losse probe geknipt  reporter en quencher gescheiden
 report geeft fluorescentie.

Aantonen antigen-antistof bindingsreacties
- Complementbindingsreactie: verbruik van complement door antigen-antistof-complex.
- ELISA = enzy lnked immunosorbent assay.
o Binding antistof of antigen in plastiek microtiterplaat + 2° antistof en enzymsubstraat
 kleurreactie, via spectrofotometer intensiteit bepalen.
- RIA = radioimmunoassay: radioactief gemerkt antigen of antistof.
- Hemagglutinatie en hemagglutinatie-inhibitie: eigenschap virus om RBC te agglutineren.

Kwantitatieve uitvoering voor bepaling titer
= hoogste verdunning van het serum waarbij het signaal wordt waargenomen

Hemagglutinatie-inhibitie voor aantonen antistoffen tegen influenzavirus
- Influenza in enveloppe HA-EW  RBC agglutineren.