Immunologie
Immunofluorescentie
Fluorescerende stof = fluorofoor = fluorochroom
Eigenschap= wnr bestraald w door licht, met een korte golflengte
licht uit zenden met langere golflengte. Excitatielicht en emissielicht.
Voorbeelden: Covid 19 is een colloidaal goud methode
Fluoresceïne (FITC): blauw groen
Rhodamine (RITC) en Texas Red: groen rood
Directe methode:
Merken van eiwitten met:
- FITC = fluoresceïne
iso-thio-cyanaat
- RITC = rhodamine
iso-thio-cyanaat
AL dat we toevoegen bij directe= speciaal omdat er meteen iets fluorisents aanhangt.
= conjugaat (Conjugaat bindt met ag)
Nadelen:
1) Door covalent binden met FITC op AL vermindert in meer of mindere mate de
affiniteit vr ag
2) Covalent binden v FITC op AL moet vr elk AL opnieuw gebeuren
3) Mindere gevoeligheid
Voordelen:
1) 1 stapmethode
2) 1 incubatiestap
3) Tijdswinst
Indirecte methode:
Primair (konijn), secundair (geit) serum
IgG-fractie v konijnenserum geit inspuiten.
antiserum tegen AL v konijn
antiAL (AAb) / secundaire AL. Primair antiserum opwekken
in konijnen incubeert histologsiche coupe die geschikte
ag bevat met:
1) Primair serum, AL binden specifiek aan ag
2) Secundair serum met AAb-FITC waardoor ag
indirect aangetoond w
Serum= GAR (goat-antirabit-serum) (indien primair AL
een mAb is v muizen secundair Ab ook aangepast w dus
RAM = Rabbit – AntiMouse-serum ipv GAR)
, Voordelen:
1) Ag, AL reactie w x verstoord door covalent gebonden FITC methode gevoeliger
2) Gevoeligheid w verhoogd door 2 stapmethode. Op AL kunnen er verschillende AAb
binden met FITC
3) 1 AAb-FITC bruikbaar is voor ieder soort ag
Fluorescentiemicroscoop:
Nadelen:
1) Donkere ruimte nodig
2) Vermoeiend voor de ogen
3) Preparaten kunnen x lang bewaard w (fading v fluorescentie) fotograferen
4) Beeld blijft niet!, moet je direct gaan opslaan op je pc
Enzymgeconjugeerde methoden
Fluorochroom vervangen door enzym
Laag moleculair gewicht, want enzym moet in
staat zijn om te binden met ag-AL want als
hem te groot is heb je anders teveel sterische
hinder om te kunnen binden.
Enzymen zelf zijn zeer belangrijk!!
Immunofluorescentie
Fluorescerende stof = fluorofoor = fluorochroom
Eigenschap= wnr bestraald w door licht, met een korte golflengte
licht uit zenden met langere golflengte. Excitatielicht en emissielicht.
Voorbeelden: Covid 19 is een colloidaal goud methode
Fluoresceïne (FITC): blauw groen
Rhodamine (RITC) en Texas Red: groen rood
Directe methode:
Merken van eiwitten met:
- FITC = fluoresceïne
iso-thio-cyanaat
- RITC = rhodamine
iso-thio-cyanaat
AL dat we toevoegen bij directe= speciaal omdat er meteen iets fluorisents aanhangt.
= conjugaat (Conjugaat bindt met ag)
Nadelen:
1) Door covalent binden met FITC op AL vermindert in meer of mindere mate de
affiniteit vr ag
2) Covalent binden v FITC op AL moet vr elk AL opnieuw gebeuren
3) Mindere gevoeligheid
Voordelen:
1) 1 stapmethode
2) 1 incubatiestap
3) Tijdswinst
Indirecte methode:
Primair (konijn), secundair (geit) serum
IgG-fractie v konijnenserum geit inspuiten.
antiserum tegen AL v konijn
antiAL (AAb) / secundaire AL. Primair antiserum opwekken
in konijnen incubeert histologsiche coupe die geschikte
ag bevat met:
1) Primair serum, AL binden specifiek aan ag
2) Secundair serum met AAb-FITC waardoor ag
indirect aangetoond w
Serum= GAR (goat-antirabit-serum) (indien primair AL
een mAb is v muizen secundair Ab ook aangepast w dus
RAM = Rabbit – AntiMouse-serum ipv GAR)
, Voordelen:
1) Ag, AL reactie w x verstoord door covalent gebonden FITC methode gevoeliger
2) Gevoeligheid w verhoogd door 2 stapmethode. Op AL kunnen er verschillende AAb
binden met FITC
3) 1 AAb-FITC bruikbaar is voor ieder soort ag
Fluorescentiemicroscoop:
Nadelen:
1) Donkere ruimte nodig
2) Vermoeiend voor de ogen
3) Preparaten kunnen x lang bewaard w (fading v fluorescentie) fotograferen
4) Beeld blijft niet!, moet je direct gaan opslaan op je pc
Enzymgeconjugeerde methoden
Fluorochroom vervangen door enzym
Laag moleculair gewicht, want enzym moet in
staat zijn om te binden met ag-AL want als
hem te groot is heb je anders teveel sterische
hinder om te kunnen binden.
Enzymen zelf zijn zeer belangrijk!!
