DNA technieken
Techniek Beschrijving Toepassingen Voordelen/ nadelen
DNA klonering* Recombinante DNA technologie - soms om een stuk DNA te - klonering vraagt een significante
-> stukken (mens) DNA knippen en amplificeren hoeveelheid aan start DNA voor de
plakken - om genen tot expressie te brengen restrictie
-> knippen met restrictie enzymes die Bv. opzuiveren van een eiwit -> eiwit - traag
de sequentie herkennen (palindroom) wordt tot expressie gebracht in een
en de fragementen knippen met bacterie en nadien opgezuiverd
vorming van sticky ends - tot expressie brengen van eiwitten in
-> DNA fragment van mens aan eukaryote cellijn**
bacterieel DNA hechten d.m.v. base Bv. ionenkanaal in een cellijn tot
paring expressie brengen en het daarna
-> DNA ligase hecht de strengen samen elektrofysiologisch via patch-clamping
= recombinante DNA molecule bestuderen
Polymerase kettingreactie PCR werkt alleen op DNA, maar via - amplificatie van kleine stukjes DNA + snelle techniek
reverse transcriptase tussenstap is het - eerste stap voor vele + hoge gevoeligheid
ook bruikbaar voor RNA. analysetechnieken + geschikt voor grote aantallen
Bv. mutatiedetectie + kan zowel voor RNA als DNA
HOE: *** - vaak eerst een stukje geamplificeerd + goedkoop
1. dubbelstrengig DNA scheiden door via deze techniek en nadien wordt de - taq polymerase dat vaak wordt
opwarming sequentie bepaald via sanger gebruikt heeft geen proofreading
2. hybridisatie van primers sequencing activiteit
3. DNA polymerase -> DNA synthese - PCR heeft specifieke primers nodig
- PCR kan maar een beperkte lengte
aan DNA amplificeren
- lage resolutie
Quantitatieve PCR (QPCR) Monitoren de amplificatie van PCR in - nauwkeurig de concentratie van DNA + snelle, nauwkeurige, kwantitatieve
realtime meten resultaten
PCR apparaat gekoppeld aan een - expressieanalyse (door meten van + exacte concentratie van DNA
fluorimeter mRNA concentratie) meten
-> lichtbron (excitatie van fluorofoor) - accurate meting van grote hoeveelheid + hoge resolutie
, -> detectiesysteem (meten van NZ in een staal + minder tijd nodig
fluorescentie) Bv. quantificatie van virussen in
klinische stalen, quantificatie van
bacteriën in voedsel, quantificatie van
genexpressie, genotypering
Nucleïnezuur hybridisatie Hybridisatie -> dubbelstrengig NZ
vormen uit enkelstreng
Enkelstrengige moleculen moeten base
complementariteit hebben. Meestal
met een gekende probe**** die
gemerkt is.
Hybridisatie door traag afkoelen. Boven
85°C worden de chromosomen
enkelstrengig -> denaturatie.
2 klassen hybridisatie assays:
1. probe wordt gemerkt -> teststaal
wordt op vaste drager aangebracht
2. teststaal wordt gemerkt -> probe
wordt op vaste drager aangebracht
Ongemerkt DNA zit altijd op vaste
drager, gemerkt DNA zit altijd in de
oplossing
Microarray Op grid zitten probes in rijtjes en 1. op DNA niveau: copy number + expressiepatroon van alle
kolommen variation bestuderen (grote menselijke genen bepalen
2 soorten: veranderingen in genoom nagaan bv. + niet zo duur
1. bevat probes die verspreid zitten over deleties) - cel- en weefselspecifieke info gaat
het volledige genoom -> genomisch 2. expressiepatroon van alle menselijke verloren
DNA van een patiënt wordt hierbij genen bepalen - geen lange, niet coderende RNA’s
gehybridiseerd Voorbeelden ***** op microarray
2. bevat probes voor alle gensequenties
van het mens genoom -> RNA wordt Bv. bij kinderen met intellectuele
gehybridiseerd handicap
Techniek Beschrijving Toepassingen Voordelen/ nadelen
DNA klonering* Recombinante DNA technologie - soms om een stuk DNA te - klonering vraagt een significante
-> stukken (mens) DNA knippen en amplificeren hoeveelheid aan start DNA voor de
plakken - om genen tot expressie te brengen restrictie
-> knippen met restrictie enzymes die Bv. opzuiveren van een eiwit -> eiwit - traag
de sequentie herkennen (palindroom) wordt tot expressie gebracht in een
en de fragementen knippen met bacterie en nadien opgezuiverd
vorming van sticky ends - tot expressie brengen van eiwitten in
-> DNA fragment van mens aan eukaryote cellijn**
bacterieel DNA hechten d.m.v. base Bv. ionenkanaal in een cellijn tot
paring expressie brengen en het daarna
-> DNA ligase hecht de strengen samen elektrofysiologisch via patch-clamping
= recombinante DNA molecule bestuderen
Polymerase kettingreactie PCR werkt alleen op DNA, maar via - amplificatie van kleine stukjes DNA + snelle techniek
reverse transcriptase tussenstap is het - eerste stap voor vele + hoge gevoeligheid
ook bruikbaar voor RNA. analysetechnieken + geschikt voor grote aantallen
Bv. mutatiedetectie + kan zowel voor RNA als DNA
HOE: *** - vaak eerst een stukje geamplificeerd + goedkoop
1. dubbelstrengig DNA scheiden door via deze techniek en nadien wordt de - taq polymerase dat vaak wordt
opwarming sequentie bepaald via sanger gebruikt heeft geen proofreading
2. hybridisatie van primers sequencing activiteit
3. DNA polymerase -> DNA synthese - PCR heeft specifieke primers nodig
- PCR kan maar een beperkte lengte
aan DNA amplificeren
- lage resolutie
Quantitatieve PCR (QPCR) Monitoren de amplificatie van PCR in - nauwkeurig de concentratie van DNA + snelle, nauwkeurige, kwantitatieve
realtime meten resultaten
PCR apparaat gekoppeld aan een - expressieanalyse (door meten van + exacte concentratie van DNA
fluorimeter mRNA concentratie) meten
-> lichtbron (excitatie van fluorofoor) - accurate meting van grote hoeveelheid + hoge resolutie
, -> detectiesysteem (meten van NZ in een staal + minder tijd nodig
fluorescentie) Bv. quantificatie van virussen in
klinische stalen, quantificatie van
bacteriën in voedsel, quantificatie van
genexpressie, genotypering
Nucleïnezuur hybridisatie Hybridisatie -> dubbelstrengig NZ
vormen uit enkelstreng
Enkelstrengige moleculen moeten base
complementariteit hebben. Meestal
met een gekende probe**** die
gemerkt is.
Hybridisatie door traag afkoelen. Boven
85°C worden de chromosomen
enkelstrengig -> denaturatie.
2 klassen hybridisatie assays:
1. probe wordt gemerkt -> teststaal
wordt op vaste drager aangebracht
2. teststaal wordt gemerkt -> probe
wordt op vaste drager aangebracht
Ongemerkt DNA zit altijd op vaste
drager, gemerkt DNA zit altijd in de
oplossing
Microarray Op grid zitten probes in rijtjes en 1. op DNA niveau: copy number + expressiepatroon van alle
kolommen variation bestuderen (grote menselijke genen bepalen
2 soorten: veranderingen in genoom nagaan bv. + niet zo duur
1. bevat probes die verspreid zitten over deleties) - cel- en weefselspecifieke info gaat
het volledige genoom -> genomisch 2. expressiepatroon van alle menselijke verloren
DNA van een patiënt wordt hierbij genen bepalen - geen lange, niet coderende RNA’s
gehybridiseerd Voorbeelden ***** op microarray
2. bevat probes voor alle gensequenties
van het mens genoom -> RNA wordt Bv. bij kinderen met intellectuele
gehybridiseerd handicap
