1. Biomerker onderzoek: vloeibare biopten (LB) [10]
1.1. Wat zijn biomerkers?
❥ Er zijn verschillende soorten biomerkers…
❣ Prognostisch: biomerkers benut voor de prognose (ziekteverloop) van een patiënt te bepalen zonder
behandeling
❣ Predictief
⤷ Biomerker die voorspelt of een patient in aanmerking komt voor een bepaalde behandeling
⤷ Zorgt voor drie dingen:
⧙ Zorgt voor correcte en relevante behandeling wat onnodige kosten verminderd
⧙ Benut om follow-up te bepalen (nodig en zo ja, hoe veel?)
⧙ Kan aantonen of additionele behandelingen vereist zijn
❣ Follow-up
⤷ Biomerker om de follow-up te bepalen van een tumor
⤷ Kan bv. via imaging
⧙ Niet zo sensitief: grote veranderingen vereist eens iets wordt gedetecteerd
⧙ Bv.: PET, SPECT, CT, etc.
❣ Screening (komt aan bod)
1.2. Vloeibare biopten verworven uit plasma
1.2.A. Concept van LB
❥ Berust op het concept van NIPT
❣ NIPT = niet-invasief prenatale testing
❣ Circulerend vrij DNA (cfDNA) van de foetus wordt gebruikt om genomische abnormaliteiten (zoals
CNV) na te gaan
❥ Bij LB wordt i.p.v. foetaal cfDNA, tumor cfDNA geanalyseerd
❥ Hoe wordt cfDNA nu gecreëerd?
1. Celdood
⤷ Apoptose zal voornamelijk zorgen voor het vrijkomen van genetisch materiaal in de bloedbaan
⤷ Necrose kan ook bijdragen maar zorgt voor genetisch materiaal dat meer gefragmenteerd is en van
minder goede kwaliteit (gedegradeerd) is
2. Actieve secretie (vrijstelling cfDNA zonder celdood)
,1.2.B. LB in follow-up
❥ Hoe effectief zijn LB nu voor de opvolging (follow-up) van therapie i.v.m. imaging?
❥ Dit werd onderzocht door volgende studie
❣ Setup:
⤷ ctDNA-gehalte (circulerend tumor DNA) werd bepaald doorheen het volgen van een behandeling
(CT + targetbehandeling)
⤷ Baseline ctDNA zat rond 60%: dit is erg veel en zal vaak lager zitten maar de resultaten blijven
alsnog gelijkend alhoewel sensitievere technieken vereist zullen zijn
⤷ De resultaten van de LB werden vervolgens vergeleken met de resultaten van imaging (SD = stable
disease: PR = partial response)
❣ Resultaten:
⤷ Na behandeling begon ctDNA te dalen tot ± 0% bij zowel
een algemene grafiek (0-600 dagen) en een ingezoomde
grafiek (0-200 dagen); dit wijst op het krimpen van de tumor
(≠ tumorregressie)
⤷ Bij de ingezoomde grafiek zien we echter een stijging van
ctDNA na 50 dagen, echter zijn er geen bloedafname
hiertussen waardoor de periode tussen de twee
opeenvolgende bloedafnamen ongekend is (is her hierin
weer gedaald of is het erg gestegen en terug gedaald?)
⤷ Over het algemeen gaven de LB resultaten gelijkend aan
imaging
⤷ Vertalen deze resultaten zich echter bij screening?
❣ Ideale techniek om in deze studie ctDNA te bepalen: digital
droplet PCR
⤷ Hoge sensitiviteit
⤷ Beperkte aantal merkers die je kan bepalen per keer
❣ Voorbeeld biomerker die kan worden gecheckt: NPY-methylatie
⤷ Biomerker relevant voor CRC
⤷ Vaak weinig aanwezig = sensitieve techniek vereist
1.2.C. LB in screening
① Borstkanker
❥ Huidige screeningsprocedure berust op tweejaarlijkse mammografie voor vrouwen tussen 50-69 jaar
❥ Het aantal mensen dat mammografieën doet is echter slechts 61,6%; dit is niet zeer veel
❥ Dit kan mede komen door het feit dat mammografieën als eng, invasief, pijnlijk of schaamtelijk worden
beschouwd
❥ Mammografie heeft ook een valkuil: DCIS
❣ DCIS = ductaal carcinoma in situ
❣ Een gezwel waarbij slechts 20% maligne wordt
❣ Ondanks deze onzekerheid wordt het toch altijd behandeld wat
vragen kan opwekken m.b.t. overbehandeling
❣ Voor deze valkuil zou LB een goede alternatief of complementaire
techniek kunnen vormen
,② Baarmoederhalskanker
❥ Huidige screeningsprocedure berust op driejaarlijkse (25-28 jaar) of vijfjaarlijkse screening (30-64 jaar)
gebruikmakend van een cervixepitheel uitstrijkje al dan niet gekoppeld aan een HPV-test (indien >30j)
❥ De respons is ongeveer gelijkend aan die van borstkanker (62,6%) wat niet zo goed is en zou moeten
verhogen
❥ Baarmoederhalskanker is traag groeiend en moet veel stappen overlopen voor hij invasief wordt:
= SIL Classificatie kan
o.b.v. cytologisch*
= CIN of histologisch
onderzoek
*Bij cytologisch onderzoek
kan men onderscheiden
tussen laaggradig en
hooggradig SIL a.d.h.v. de
kernen: LSIL heeft dubbele
kernen terwijl HSIL grote
kernen heeft.
❥ HPV-testing
❣ Niet elke HPV is oncogeen; sommige HPV-types zijn oncogeen en anderen niet
❣ Door de oncogene domeinen te testen in de aanwezige HPV kan men zien welke type aanwezig is
❣ HPV heeft een cirkelvormig genoom die hij via L1 en E2 regio’s kan integreren on het humaan
genoom
⤷ Voorbeeld: L1-testing via qPCR
⧙ Test op de aanwezigheid van L1-regio in het aanwezige HPV-genoom
⧙ Echter kunnen tijdens de integratie stukken van het L1-regio missen waardoor primer-binding niet
deftig verloopt en zorgt voor vals-negatieve resultaten
⧙ Bovendien kunnen HPV-virussen latent aanwezig zijn en deze test kan hier geen rekening mee
houden
⤷ Alternatief voor de L1-test: mRNA-gebaseerde test die E6/E7 oncogene activiteit inschat
⧙ Maakt gebruik van RT-PCR
⧛ Kan met SYBR-GREEN: goedkoop en universeel maar kan aspecifiek zijn (detecteert PCR-
fragment dat niet-viraal is t.g.v. de vorming van primer-dimers; op te lossen via optimalisatie)
⧛ Kan via probes: duurder maar veel specifieker
⤷ Ook sequencing kan worden benut
❥ PAP-test (cytologisch onderzoek) kent matige gevoeligheid bij vroege stadia en kent interoperator
variabiliteit (subjectiviteit bij evaluatie van uitstrijkje)
❥ Als een PAP-test positief is dan volgt een colposcopie voor real-time microscopische evaluatie en
biopsie
, ③ Dikkedarmkanker
❥ Huidige screeningsprocedure berust op tweejaarlijkse screening via iFOBT voor mannen en vrouwen
tussen 50-74 jaar
❥ De respons hierop is rond de 50% wat zeer laag is
❥ De iFOBT:
❣ iFOBT = immunochemische faeces occult bloed test
❣ Spoort kleine hoeveelheden humaan bloed op in de stoelgang via anti-hemoglobine antilichamen
❣ Een positieve resultaat staat niet gelijk aan kanker
⤷ iFOBT kan positief zijn door bloed afkomstig van zweertjes t.g.v. bv. NSAID
⤷ Als een positief resultaat wordt bekomen volgt een colonscopie, maar deze kan kanker missen en
vereist een propere darm
❣ De iFOBT kent echter valkuilen
⤷ Ongeschikt bij grote hoeveelheden bloed
⤷ Sommige CRC letsels bloeden niet of niet continu wat kan leiden op vals negatieve resultaten
⤷ Kan niet worden afgenomen tijdens de menstruatie of bij aanwezigheid van aambeien of bij
hematurie (leiden tot vals positieve resultaten)
④ Valkuilen
Screeningsprogramma’s zijn zeer goed en helpen bij de vroegdetectie van kanker maar er zijn minpunten:
1. Respons zitten nog zeer laag en moeten hoger (50-60% is niet goed genoeg), mogelijks kunnen LB dit
remediëren en de cijfers hoger krijgen
2. Overdiagnose kan een probleem zijn: het lichaam bezit redelijk vaak tumoraal materiaal dat het IMS
goed opruimt wat zou leiden tot overdiagnose
3. Sensitiviteit vormt nog een probleem
❣ Er is een bepaalde minimale tumorload nodig vooraleer het wordt gedetecteerd
❣ Sommige tumoren hebben veel shedding terwijl andere weinig shedding hebben maar dit kan
worden opgelost via de opstelling van signaturen per tumortype
1.2.D. LB in de praktijk: GRAIL
① Wat is GRAIL
❥ GRAIL is een project dat zorgt voor het aanvullen van het CCGA (circulating cell-free genome atlas):
CGA tracht de cf-fragmenten die in het bloed circuleren te identificeren
❥ Doel van GRAIL: het maken van een MCED (multi-cancer early detection) test
❥ GRAIL omvat 3 belangrijke studies
1. Een studie die tracht te bepalen welke techniek het best werkt hierbij wordt gekeken naar
verschillende modaliteiten (methylatiepatronen, CNV, RNA, DNA, etc.)
2. Finetuning van WGBS naar een targeted panel: o.b.v. WGBS-data wordt een targeted panel
opgesteld van een aantal interessante/relevante genen om continue WGBS te vermijden door kosten
3. Klinische validatie van de ontwikkelde test uit 2. (werkt het werkelijk in mensen?)
❥ Vaak gebruikte aanpak
1. Weefsel
⤷ Tumor wordt vergeleken met gezond weefsel
⤷ Biomerkers worden o.b.v. deze analyse geselecteerd
2. Cf-fragmenten in plasma: de gekozen biomerkers worden getest en er wordt gekeken welke effectief
ook in deze fase terug voorkomen
1.1. Wat zijn biomerkers?
❥ Er zijn verschillende soorten biomerkers…
❣ Prognostisch: biomerkers benut voor de prognose (ziekteverloop) van een patiënt te bepalen zonder
behandeling
❣ Predictief
⤷ Biomerker die voorspelt of een patient in aanmerking komt voor een bepaalde behandeling
⤷ Zorgt voor drie dingen:
⧙ Zorgt voor correcte en relevante behandeling wat onnodige kosten verminderd
⧙ Benut om follow-up te bepalen (nodig en zo ja, hoe veel?)
⧙ Kan aantonen of additionele behandelingen vereist zijn
❣ Follow-up
⤷ Biomerker om de follow-up te bepalen van een tumor
⤷ Kan bv. via imaging
⧙ Niet zo sensitief: grote veranderingen vereist eens iets wordt gedetecteerd
⧙ Bv.: PET, SPECT, CT, etc.
❣ Screening (komt aan bod)
1.2. Vloeibare biopten verworven uit plasma
1.2.A. Concept van LB
❥ Berust op het concept van NIPT
❣ NIPT = niet-invasief prenatale testing
❣ Circulerend vrij DNA (cfDNA) van de foetus wordt gebruikt om genomische abnormaliteiten (zoals
CNV) na te gaan
❥ Bij LB wordt i.p.v. foetaal cfDNA, tumor cfDNA geanalyseerd
❥ Hoe wordt cfDNA nu gecreëerd?
1. Celdood
⤷ Apoptose zal voornamelijk zorgen voor het vrijkomen van genetisch materiaal in de bloedbaan
⤷ Necrose kan ook bijdragen maar zorgt voor genetisch materiaal dat meer gefragmenteerd is en van
minder goede kwaliteit (gedegradeerd) is
2. Actieve secretie (vrijstelling cfDNA zonder celdood)
,1.2.B. LB in follow-up
❥ Hoe effectief zijn LB nu voor de opvolging (follow-up) van therapie i.v.m. imaging?
❥ Dit werd onderzocht door volgende studie
❣ Setup:
⤷ ctDNA-gehalte (circulerend tumor DNA) werd bepaald doorheen het volgen van een behandeling
(CT + targetbehandeling)
⤷ Baseline ctDNA zat rond 60%: dit is erg veel en zal vaak lager zitten maar de resultaten blijven
alsnog gelijkend alhoewel sensitievere technieken vereist zullen zijn
⤷ De resultaten van de LB werden vervolgens vergeleken met de resultaten van imaging (SD = stable
disease: PR = partial response)
❣ Resultaten:
⤷ Na behandeling begon ctDNA te dalen tot ± 0% bij zowel
een algemene grafiek (0-600 dagen) en een ingezoomde
grafiek (0-200 dagen); dit wijst op het krimpen van de tumor
(≠ tumorregressie)
⤷ Bij de ingezoomde grafiek zien we echter een stijging van
ctDNA na 50 dagen, echter zijn er geen bloedafname
hiertussen waardoor de periode tussen de twee
opeenvolgende bloedafnamen ongekend is (is her hierin
weer gedaald of is het erg gestegen en terug gedaald?)
⤷ Over het algemeen gaven de LB resultaten gelijkend aan
imaging
⤷ Vertalen deze resultaten zich echter bij screening?
❣ Ideale techniek om in deze studie ctDNA te bepalen: digital
droplet PCR
⤷ Hoge sensitiviteit
⤷ Beperkte aantal merkers die je kan bepalen per keer
❣ Voorbeeld biomerker die kan worden gecheckt: NPY-methylatie
⤷ Biomerker relevant voor CRC
⤷ Vaak weinig aanwezig = sensitieve techniek vereist
1.2.C. LB in screening
① Borstkanker
❥ Huidige screeningsprocedure berust op tweejaarlijkse mammografie voor vrouwen tussen 50-69 jaar
❥ Het aantal mensen dat mammografieën doet is echter slechts 61,6%; dit is niet zeer veel
❥ Dit kan mede komen door het feit dat mammografieën als eng, invasief, pijnlijk of schaamtelijk worden
beschouwd
❥ Mammografie heeft ook een valkuil: DCIS
❣ DCIS = ductaal carcinoma in situ
❣ Een gezwel waarbij slechts 20% maligne wordt
❣ Ondanks deze onzekerheid wordt het toch altijd behandeld wat
vragen kan opwekken m.b.t. overbehandeling
❣ Voor deze valkuil zou LB een goede alternatief of complementaire
techniek kunnen vormen
,② Baarmoederhalskanker
❥ Huidige screeningsprocedure berust op driejaarlijkse (25-28 jaar) of vijfjaarlijkse screening (30-64 jaar)
gebruikmakend van een cervixepitheel uitstrijkje al dan niet gekoppeld aan een HPV-test (indien >30j)
❥ De respons is ongeveer gelijkend aan die van borstkanker (62,6%) wat niet zo goed is en zou moeten
verhogen
❥ Baarmoederhalskanker is traag groeiend en moet veel stappen overlopen voor hij invasief wordt:
= SIL Classificatie kan
o.b.v. cytologisch*
= CIN of histologisch
onderzoek
*Bij cytologisch onderzoek
kan men onderscheiden
tussen laaggradig en
hooggradig SIL a.d.h.v. de
kernen: LSIL heeft dubbele
kernen terwijl HSIL grote
kernen heeft.
❥ HPV-testing
❣ Niet elke HPV is oncogeen; sommige HPV-types zijn oncogeen en anderen niet
❣ Door de oncogene domeinen te testen in de aanwezige HPV kan men zien welke type aanwezig is
❣ HPV heeft een cirkelvormig genoom die hij via L1 en E2 regio’s kan integreren on het humaan
genoom
⤷ Voorbeeld: L1-testing via qPCR
⧙ Test op de aanwezigheid van L1-regio in het aanwezige HPV-genoom
⧙ Echter kunnen tijdens de integratie stukken van het L1-regio missen waardoor primer-binding niet
deftig verloopt en zorgt voor vals-negatieve resultaten
⧙ Bovendien kunnen HPV-virussen latent aanwezig zijn en deze test kan hier geen rekening mee
houden
⤷ Alternatief voor de L1-test: mRNA-gebaseerde test die E6/E7 oncogene activiteit inschat
⧙ Maakt gebruik van RT-PCR
⧛ Kan met SYBR-GREEN: goedkoop en universeel maar kan aspecifiek zijn (detecteert PCR-
fragment dat niet-viraal is t.g.v. de vorming van primer-dimers; op te lossen via optimalisatie)
⧛ Kan via probes: duurder maar veel specifieker
⤷ Ook sequencing kan worden benut
❥ PAP-test (cytologisch onderzoek) kent matige gevoeligheid bij vroege stadia en kent interoperator
variabiliteit (subjectiviteit bij evaluatie van uitstrijkje)
❥ Als een PAP-test positief is dan volgt een colposcopie voor real-time microscopische evaluatie en
biopsie
, ③ Dikkedarmkanker
❥ Huidige screeningsprocedure berust op tweejaarlijkse screening via iFOBT voor mannen en vrouwen
tussen 50-74 jaar
❥ De respons hierop is rond de 50% wat zeer laag is
❥ De iFOBT:
❣ iFOBT = immunochemische faeces occult bloed test
❣ Spoort kleine hoeveelheden humaan bloed op in de stoelgang via anti-hemoglobine antilichamen
❣ Een positieve resultaat staat niet gelijk aan kanker
⤷ iFOBT kan positief zijn door bloed afkomstig van zweertjes t.g.v. bv. NSAID
⤷ Als een positief resultaat wordt bekomen volgt een colonscopie, maar deze kan kanker missen en
vereist een propere darm
❣ De iFOBT kent echter valkuilen
⤷ Ongeschikt bij grote hoeveelheden bloed
⤷ Sommige CRC letsels bloeden niet of niet continu wat kan leiden op vals negatieve resultaten
⤷ Kan niet worden afgenomen tijdens de menstruatie of bij aanwezigheid van aambeien of bij
hematurie (leiden tot vals positieve resultaten)
④ Valkuilen
Screeningsprogramma’s zijn zeer goed en helpen bij de vroegdetectie van kanker maar er zijn minpunten:
1. Respons zitten nog zeer laag en moeten hoger (50-60% is niet goed genoeg), mogelijks kunnen LB dit
remediëren en de cijfers hoger krijgen
2. Overdiagnose kan een probleem zijn: het lichaam bezit redelijk vaak tumoraal materiaal dat het IMS
goed opruimt wat zou leiden tot overdiagnose
3. Sensitiviteit vormt nog een probleem
❣ Er is een bepaalde minimale tumorload nodig vooraleer het wordt gedetecteerd
❣ Sommige tumoren hebben veel shedding terwijl andere weinig shedding hebben maar dit kan
worden opgelost via de opstelling van signaturen per tumortype
1.2.D. LB in de praktijk: GRAIL
① Wat is GRAIL
❥ GRAIL is een project dat zorgt voor het aanvullen van het CCGA (circulating cell-free genome atlas):
CGA tracht de cf-fragmenten die in het bloed circuleren te identificeren
❥ Doel van GRAIL: het maken van een MCED (multi-cancer early detection) test
❥ GRAIL omvat 3 belangrijke studies
1. Een studie die tracht te bepalen welke techniek het best werkt hierbij wordt gekeken naar
verschillende modaliteiten (methylatiepatronen, CNV, RNA, DNA, etc.)
2. Finetuning van WGBS naar een targeted panel: o.b.v. WGBS-data wordt een targeted panel
opgesteld van een aantal interessante/relevante genen om continue WGBS te vermijden door kosten
3. Klinische validatie van de ontwikkelde test uit 2. (werkt het werkelijk in mensen?)
❥ Vaak gebruikte aanpak
1. Weefsel
⤷ Tumor wordt vergeleken met gezond weefsel
⤷ Biomerkers worden o.b.v. deze analyse geselecteerd
2. Cf-fragmenten in plasma: de gekozen biomerkers worden getest en er wordt gekeken welke effectief
ook in deze fase terug voorkomen
