Gastcollege IVF: laboratory aspects of in-vitro
Laboratory aspects
In petrischaal: zaadcellen en eicellen voorbereiden, dan samenvoegen en terugplaatsen
- IUI: alleen zaadcellen voorbereiden
- IVF: eicellen ook voorbereid
- ICSI: 1 zaadcel in eicel geïnjecteerd
De zaadcel
1. Zaadcel analyse voor diagnose te stellen
Concentratie bepalen a.d.h.v. telkamer: zaadcellen worden geïmmobiliseerd
- 15 miljoen/ml of minstens dan 39 miljoen per ejaculatie
- Indien minder: oligozospermia
Bewegelijkheid: 4 typen
1. Snel progressief beweeglijk: > 25 μm/s
2. Traag progressief beweeglijk: 5-25 μm/s
3. Niet-progressief beweeglijk: < 5 μm/s, bewegen wel maar gaan niet vooruit
4. Onbeweeglijk: 0 μm/s
Goede staal:
- > 32% progressieve spermacellen of > 40% totale motiele spermacellen
o Indien minder: asthenozo-spermia
- Onbeweeglijk: zijn ze vitaal of niet? Kijken via vitaliteitstest
o Kleurstof toevoegen. Als membraan kapot is gaat zaadcel kleur opnemen
o Als zaadcel kleur niet opneemt leven ze nog, dan kunnen ze nog gebruikt worden
- Categene-syndroom: afwijking staart waardoor tubuli niet schuiven & beweging niet
doorkomt
o = levende zaadcellen maar bewegen niet ICSI
- Necrozo-spermia: er zijn wel spermacellen maar ze zijn allemaal dood MESA of TESA
Mature spermatozoa: vorm
- Mooie ovale kop met DNA
- Rond kop: acrosoom met enzymen die nodig zijn om eicel te doorbreken
- In middenstuk zitten de mitochondria, beweging adhv staart
- In humaan: 4% normale vorm = normaal! < 4% = teratozo-spermia
o Kop: te groot, te langwerpig, puntvormig, vastgebonden aan middenstuk, geen of
minder acrosoom. Middenstuk: dubbel, geen mitochondriën. Staart: gekruld, …..
- In teelbal is spermacel al volledig matuur
o Er is vaak nog cytoplasma van de voorlopercel dat vasthangt aan het middenstuk
o Deze wordt verwijdert als de zaadcel in epididymis komt: laatste stap van maturatie
Immunologische afwijkingen van de spermacellen:
- Gevormde zaadcellen zijn goed beschermd in teelbal door bloed-testiculaire barrière
- Immuunsysteem weet niet van deze antigenenproductie
- Bij bv. trauma: bloed-testis barrière beschadigd bloed in contact met zaadcellen
- Immuunsysteem reageert en lichaam vormt antilichamen tegen eigen zaadcellen
o Sperma-antistoffen kunnen op kop binden: bevruchting benadeeld
o Op middenstuk of staart: beweeglijkheid benadeeld
- volgens hoeveelheid antistoffen: samenklitten van zaadcellen
, Mar-test: Latex partikels gecoat met EGG en EGA binden op spermacel, hier zitten de antilichamen
Roundcells:
- Cellen tussen zaadcellen, zijn groter dan zaadcel zelf
- Kunnen immature spermacellen zijn, of leukocyten zijn:
- Vaststellen a.d.h.v. kleuringstest met benzidine/phloxine B
o Neutrofielen met peroxidase enzymen kunnen beweeglijkheid zaadcel benadelen
o > 1M roundcells in staal: differentiatie uitvoeren om te zien of het neutrofielen zijn
2. Staal voorbereiden
1. Zoals in vivo seminal plasma verwijderen door te wassen
o Heeft decapaciterende factoren: blokkeren zaadcellen om eicellen te bevruchten
o Zo is spermacel pas klaar tegen dat die de eicel moet bevruchten
2. Beweeglijke spermacellen met goede vorm scheiden van rest (vrij van debris)
Gradiënt centrifugatie: oplossing met 2 versch concentraties op elkaar gradiënt
o Daarop semenstaal: bij centrifugeren na 15 min beste deel onderaan
o Selectie op basis van beweeglijkheid én vorm
- Swim-up: semenstaal onder oplosmedium laten staan
o Goed beweeglijke sperma kan opzwemmen naar opl. erboven die gebruiken
o Minder recuperatie + enkel beweeglijkheid, geen vorm
Criteria:
- Therapie gebaseerd op de staal ná voorbereiding!
o Ookal lage concentraties in totaal, misschien heel veel goede vorm en beweeglijkheid
- IUI: >= 2M progressieve, motiele spermacellen
- IVF: > 0,5M progressieve, motiele spermacellen
- ICSI: >= 1 viabele spermacel
Afwijkingen:
- Oligospermi: < 15M/ml concentratie
- Asthenozospermi: <32% progressief motiel
- Teratozospermi: < 4% normale vorm
- Azoospermi: geen enkele aanwezig in ejaculaat
o Secretoir: probleem in spermatogenese
o Excretoir: blokkade in epididymis of vas deferens
3. Zaadcel verkrijgingstechnieken
- Normaal door masturbatie. Indien hier geen levende spermacellen in zitten:
- MESA:
o Microchirurgical epididymal sperm aspiration
o Vocht wordt direct uit epididymis gezogen (bijna niet meer gebruikt)
- TESE:
o Testicular sperm extraction via testis biopsy
o Incissie in teelbal op 3 niveaus, tubuli die eruit komen eruit knippen
o Tubuli uit elkaar getrokken, gemolken zaadcellen gebruikt voor micro-manipulatie
4. Sperma DNA fragmentatie test of DNA-breuken test
- Grootste reden van onvruchtbaarheid mens is foute sperma-functie mislukte fertilisatie
- Dan maar IVF, als dat niet werkt, ICSI = bypass van natuurlijke selectie
- In natuur: bijdrage tot gezond kind: 70-80% van eicel, 10-15% van zaadcel
o Abnormaliteit zaadcel zaadcel veel grotere invloed op embryo en innesteling
- Fertilisatie dus bereikt in vitro met sperma dat nooit had kunnen gebruikt geweest in vivo
Laboratory aspects
In petrischaal: zaadcellen en eicellen voorbereiden, dan samenvoegen en terugplaatsen
- IUI: alleen zaadcellen voorbereiden
- IVF: eicellen ook voorbereid
- ICSI: 1 zaadcel in eicel geïnjecteerd
De zaadcel
1. Zaadcel analyse voor diagnose te stellen
Concentratie bepalen a.d.h.v. telkamer: zaadcellen worden geïmmobiliseerd
- 15 miljoen/ml of minstens dan 39 miljoen per ejaculatie
- Indien minder: oligozospermia
Bewegelijkheid: 4 typen
1. Snel progressief beweeglijk: > 25 μm/s
2. Traag progressief beweeglijk: 5-25 μm/s
3. Niet-progressief beweeglijk: < 5 μm/s, bewegen wel maar gaan niet vooruit
4. Onbeweeglijk: 0 μm/s
Goede staal:
- > 32% progressieve spermacellen of > 40% totale motiele spermacellen
o Indien minder: asthenozo-spermia
- Onbeweeglijk: zijn ze vitaal of niet? Kijken via vitaliteitstest
o Kleurstof toevoegen. Als membraan kapot is gaat zaadcel kleur opnemen
o Als zaadcel kleur niet opneemt leven ze nog, dan kunnen ze nog gebruikt worden
- Categene-syndroom: afwijking staart waardoor tubuli niet schuiven & beweging niet
doorkomt
o = levende zaadcellen maar bewegen niet ICSI
- Necrozo-spermia: er zijn wel spermacellen maar ze zijn allemaal dood MESA of TESA
Mature spermatozoa: vorm
- Mooie ovale kop met DNA
- Rond kop: acrosoom met enzymen die nodig zijn om eicel te doorbreken
- In middenstuk zitten de mitochondria, beweging adhv staart
- In humaan: 4% normale vorm = normaal! < 4% = teratozo-spermia
o Kop: te groot, te langwerpig, puntvormig, vastgebonden aan middenstuk, geen of
minder acrosoom. Middenstuk: dubbel, geen mitochondriën. Staart: gekruld, …..
- In teelbal is spermacel al volledig matuur
o Er is vaak nog cytoplasma van de voorlopercel dat vasthangt aan het middenstuk
o Deze wordt verwijdert als de zaadcel in epididymis komt: laatste stap van maturatie
Immunologische afwijkingen van de spermacellen:
- Gevormde zaadcellen zijn goed beschermd in teelbal door bloed-testiculaire barrière
- Immuunsysteem weet niet van deze antigenenproductie
- Bij bv. trauma: bloed-testis barrière beschadigd bloed in contact met zaadcellen
- Immuunsysteem reageert en lichaam vormt antilichamen tegen eigen zaadcellen
o Sperma-antistoffen kunnen op kop binden: bevruchting benadeeld
o Op middenstuk of staart: beweeglijkheid benadeeld
- volgens hoeveelheid antistoffen: samenklitten van zaadcellen
, Mar-test: Latex partikels gecoat met EGG en EGA binden op spermacel, hier zitten de antilichamen
Roundcells:
- Cellen tussen zaadcellen, zijn groter dan zaadcel zelf
- Kunnen immature spermacellen zijn, of leukocyten zijn:
- Vaststellen a.d.h.v. kleuringstest met benzidine/phloxine B
o Neutrofielen met peroxidase enzymen kunnen beweeglijkheid zaadcel benadelen
o > 1M roundcells in staal: differentiatie uitvoeren om te zien of het neutrofielen zijn
2. Staal voorbereiden
1. Zoals in vivo seminal plasma verwijderen door te wassen
o Heeft decapaciterende factoren: blokkeren zaadcellen om eicellen te bevruchten
o Zo is spermacel pas klaar tegen dat die de eicel moet bevruchten
2. Beweeglijke spermacellen met goede vorm scheiden van rest (vrij van debris)
Gradiënt centrifugatie: oplossing met 2 versch concentraties op elkaar gradiënt
o Daarop semenstaal: bij centrifugeren na 15 min beste deel onderaan
o Selectie op basis van beweeglijkheid én vorm
- Swim-up: semenstaal onder oplosmedium laten staan
o Goed beweeglijke sperma kan opzwemmen naar opl. erboven die gebruiken
o Minder recuperatie + enkel beweeglijkheid, geen vorm
Criteria:
- Therapie gebaseerd op de staal ná voorbereiding!
o Ookal lage concentraties in totaal, misschien heel veel goede vorm en beweeglijkheid
- IUI: >= 2M progressieve, motiele spermacellen
- IVF: > 0,5M progressieve, motiele spermacellen
- ICSI: >= 1 viabele spermacel
Afwijkingen:
- Oligospermi: < 15M/ml concentratie
- Asthenozospermi: <32% progressief motiel
- Teratozospermi: < 4% normale vorm
- Azoospermi: geen enkele aanwezig in ejaculaat
o Secretoir: probleem in spermatogenese
o Excretoir: blokkade in epididymis of vas deferens
3. Zaadcel verkrijgingstechnieken
- Normaal door masturbatie. Indien hier geen levende spermacellen in zitten:
- MESA:
o Microchirurgical epididymal sperm aspiration
o Vocht wordt direct uit epididymis gezogen (bijna niet meer gebruikt)
- TESE:
o Testicular sperm extraction via testis biopsy
o Incissie in teelbal op 3 niveaus, tubuli die eruit komen eruit knippen
o Tubuli uit elkaar getrokken, gemolken zaadcellen gebruikt voor micro-manipulatie
4. Sperma DNA fragmentatie test of DNA-breuken test
- Grootste reden van onvruchtbaarheid mens is foute sperma-functie mislukte fertilisatie
- Dan maar IVF, als dat niet werkt, ICSI = bypass van natuurlijke selectie
- In natuur: bijdrage tot gezond kind: 70-80% van eicel, 10-15% van zaadcel
o Abnormaliteit zaadcel zaadcel veel grotere invloed op embryo en innesteling
- Fertilisatie dus bereikt in vitro met sperma dat nooit had kunnen gebruikt geweest in vivo
