SAMENVATTING FLOWCYTOMETRIE
FLOWCYTOMETRIE
= het meten van cytocellen in een flow (stroom). We brengen een celsuspensie in een stroom
geleidingsvloeistof. Dit wordt aangestraald door een lichtbron, waardoor men bepaalde parameters
kan analyseren.
TOEPASSINGEN :
- Witte bloedcellen onderscheiden adhv specifieke eiwitten op celmembraan. B-cellen: CD19 T
cellen: CD3.
- HIV gebruikt als gastcel, T-cellen aantal T cellen zal drastisch afnemen
- Voorafgaand aan orgaantransplantatie kijk of donor en ontvanger een match zijn
DE VOORWAARDEN VOOR EEN FLOWCYTOMETRISCH EXPERIMENT:
1. INDIVIDUELE CELLEN IN OPLOSSING (SINGLE CELL SUSPENSIE)
Bepaalde cellen zijn zeer geschikt voor flowcytometrie, bv. rode bloedcellen (die zitten al in single cell
suspensie). Geen volledige weefsels maar wel door het biopt enzymatisch te behandelen met bv.
Collagenase, of door mechanisch snijden en filteren.
Eigenlijk kan elk partikel of cel met bepaalde grootte geanalyseerd worden m.b.v. flowcytometrie.
2. HYDRODYNAMISCHE FOCUSSERING
Dit dient voor het aligneren van de individuele cellen, zodat ze apart kunnen aangestraald worden.
Dit kan alleen gebeuren als de vloeistofstroom laminair is
EEN FLOWCYTOMETER BESTAAT DOORGAANS UIT 3 BELANGRIJKE DELEN:
1. Fluidica: de vloeistof die in bidons zit
2. Optica: het toestel zelf, dit is de optische bank
3. Elektronica: het computersysteem om de data te versterken en analyseren
1. FLUIDICA:
Dient voor transport van de cellen naar de lichtbron om daar lichtsignalen te veroorzaken. Lasers
zullen de vloeistof aanstralen, en daardoor lichtsignalen genereren die opgevangen worden door het
optisch systeem.
De flowcel is de plek waar de laser op de stroom zal instralen om zo de cellen te exciteren of
aanstralen.
, De sheath tank bevat de geleidingsvloeistof. Deze heeft een lagere druk en snelheid als de staal
(snelheid ~ druk). Daardoor mengen ze niet, aligneren de cellen zich = hydrodynamisch focusseren.
Hierdoor kunnen ze één per één aangestraald worden. Deze hydrodynamische focussering kan enkel
gebeuren als de vloeistofstroom laminair is:
Re < 2300: laminaire stroming Re > 3500: turbulente stroming
Re = Reynoldsgetal, wordt bepaald door de opening waardoor de vloeistof wordt geduwd, snelheid …
2. OPTICA
Een lichtbron (laser) en detectoren met filters voor. Lasers hebben een smalle, intense lichtbron met
1 golflengte (monochromatisch licht), ( λ ≈ 488 nm (blauw)). Lasers kunnen sterk focussen en
hebben hoge energie.
De laser straalt de vloeistofstroom aan, en bij passage van een cel wordt het licht verstrooid.
Wanneer de cel centraal in de lichtbundel zit, is het lichtsignaal maximaal. De passage van elke cel zal
een lichtpuls veroorzaken. De lichtverstrooiing op zich geeft al info over de cel:
- Afgebogen licht: forward scatter relatieve grootte van de cel
- Gebroken en teruggekaatst licht: side scatter interne/externe complexiteit, granuliteit
Elastische lichtverstrooiing: golflengte van geëxciteerde licht = golflengte geëmitteerde licht
Niet-elastische lichtverstrooiing: golflengte geëxciteerde licht ≠ golflengte geëmitteerde licht
De energie van het geëmitteerde licht is gedaald fluorescentie meten.
Moleculaire extinctiecoëfficiënt is eigen voor elk molecule excitatiesepctrum van
golflengten waarbij een molecule kan geëxciteerd worden met een bepaald
excitatiemaximum.
geëmitteerde fotonen
Quantumopbrengst =
geëxciteerde fotonen
Verschillende fluorescenties met verschillende golflengten moeten elk op de juiste detector terecht
komen. Hiervoor zitten er filters in de optische bank.
In totaal zijn er 4 belangrijke filters:
1. Longpass (LP) met bepaalde golflengte (bv. 500 nm licht vanaf 500 nm doorgelaten)
2. Shortpass (SP) met bepaalde golflengte (bv. 500 nm licht onder 500 nm doorgelaten)
3. BP (bandpass) met bepaalde golflengte (bv. 500/50 475 tot 525 nm doorgelaten)
4.
Er zijn ook dischroïsche spiegels aanwezig. Deze laten bepaalde golflengten door, en weerkaatsen
andere.
3. ELEKTRONICA
FLOWCYTOMETRIE
= het meten van cytocellen in een flow (stroom). We brengen een celsuspensie in een stroom
geleidingsvloeistof. Dit wordt aangestraald door een lichtbron, waardoor men bepaalde parameters
kan analyseren.
TOEPASSINGEN :
- Witte bloedcellen onderscheiden adhv specifieke eiwitten op celmembraan. B-cellen: CD19 T
cellen: CD3.
- HIV gebruikt als gastcel, T-cellen aantal T cellen zal drastisch afnemen
- Voorafgaand aan orgaantransplantatie kijk of donor en ontvanger een match zijn
DE VOORWAARDEN VOOR EEN FLOWCYTOMETRISCH EXPERIMENT:
1. INDIVIDUELE CELLEN IN OPLOSSING (SINGLE CELL SUSPENSIE)
Bepaalde cellen zijn zeer geschikt voor flowcytometrie, bv. rode bloedcellen (die zitten al in single cell
suspensie). Geen volledige weefsels maar wel door het biopt enzymatisch te behandelen met bv.
Collagenase, of door mechanisch snijden en filteren.
Eigenlijk kan elk partikel of cel met bepaalde grootte geanalyseerd worden m.b.v. flowcytometrie.
2. HYDRODYNAMISCHE FOCUSSERING
Dit dient voor het aligneren van de individuele cellen, zodat ze apart kunnen aangestraald worden.
Dit kan alleen gebeuren als de vloeistofstroom laminair is
EEN FLOWCYTOMETER BESTAAT DOORGAANS UIT 3 BELANGRIJKE DELEN:
1. Fluidica: de vloeistof die in bidons zit
2. Optica: het toestel zelf, dit is de optische bank
3. Elektronica: het computersysteem om de data te versterken en analyseren
1. FLUIDICA:
Dient voor transport van de cellen naar de lichtbron om daar lichtsignalen te veroorzaken. Lasers
zullen de vloeistof aanstralen, en daardoor lichtsignalen genereren die opgevangen worden door het
optisch systeem.
De flowcel is de plek waar de laser op de stroom zal instralen om zo de cellen te exciteren of
aanstralen.
, De sheath tank bevat de geleidingsvloeistof. Deze heeft een lagere druk en snelheid als de staal
(snelheid ~ druk). Daardoor mengen ze niet, aligneren de cellen zich = hydrodynamisch focusseren.
Hierdoor kunnen ze één per één aangestraald worden. Deze hydrodynamische focussering kan enkel
gebeuren als de vloeistofstroom laminair is:
Re < 2300: laminaire stroming Re > 3500: turbulente stroming
Re = Reynoldsgetal, wordt bepaald door de opening waardoor de vloeistof wordt geduwd, snelheid …
2. OPTICA
Een lichtbron (laser) en detectoren met filters voor. Lasers hebben een smalle, intense lichtbron met
1 golflengte (monochromatisch licht), ( λ ≈ 488 nm (blauw)). Lasers kunnen sterk focussen en
hebben hoge energie.
De laser straalt de vloeistofstroom aan, en bij passage van een cel wordt het licht verstrooid.
Wanneer de cel centraal in de lichtbundel zit, is het lichtsignaal maximaal. De passage van elke cel zal
een lichtpuls veroorzaken. De lichtverstrooiing op zich geeft al info over de cel:
- Afgebogen licht: forward scatter relatieve grootte van de cel
- Gebroken en teruggekaatst licht: side scatter interne/externe complexiteit, granuliteit
Elastische lichtverstrooiing: golflengte van geëxciteerde licht = golflengte geëmitteerde licht
Niet-elastische lichtverstrooiing: golflengte geëxciteerde licht ≠ golflengte geëmitteerde licht
De energie van het geëmitteerde licht is gedaald fluorescentie meten.
Moleculaire extinctiecoëfficiënt is eigen voor elk molecule excitatiesepctrum van
golflengten waarbij een molecule kan geëxciteerd worden met een bepaald
excitatiemaximum.
geëmitteerde fotonen
Quantumopbrengst =
geëxciteerde fotonen
Verschillende fluorescenties met verschillende golflengten moeten elk op de juiste detector terecht
komen. Hiervoor zitten er filters in de optische bank.
In totaal zijn er 4 belangrijke filters:
1. Longpass (LP) met bepaalde golflengte (bv. 500 nm licht vanaf 500 nm doorgelaten)
2. Shortpass (SP) met bepaalde golflengte (bv. 500 nm licht onder 500 nm doorgelaten)
3. BP (bandpass) met bepaalde golflengte (bv. 500/50 475 tot 525 nm doorgelaten)
4.
Er zijn ook dischroïsche spiegels aanwezig. Deze laten bepaalde golflengten door, en weerkaatsen
andere.
3. ELEKTRONICA
