THK1 - Examenvragen Algemene weefselleer: (2025-2026)
Open vragen (leg uit aan de hand van een tekening en geef de nodige uitleg):
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie
elektronenmicroscopie (TEM). Wat kan je met beide technieken onderzoeken?
Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt worden voor deze methoden
en waarom?
Conventionele lichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie worden beide gebruikt om
weefsels en cellen te bestuderen, maar verschillen sterk in resolutie, beeldvorming en
staalvoorbereiding.
Met de lichtmicroscoop bestudeer je vooral de algemene cel- en weefselstructuur. Het maakt
gebruik van zichtbaar licht (fotonen). Je kan cellen, celkernen en grotere organellen herkennen en
de organisatie weefsels beoordelen, maar de resolutie in beperkt tot ongeveer 0,2 µm, waardoor
fijne ultrastructuren niet zichtbaar zijn. Voorbereiding van het weefsel omvat fixatie (meestal met
formol / formaldehyde) om afbraakprocessen te stoppen via crosslinking van eiwitten en zo de
structuur te bewaren. Daarna volgt dehydratie, inbedding in paraffine en het snijden van coupes
van 5-10 µm met een microtoom. Vervolgens worden de coupes gedeparaffineerd en gekleurd om
structuren zichtbaar te maken. Ook invriezen met OCT en cryocoupes is mogelijk voor bepaalde
toepassingen zoals immunokleuringen.
De TEM wordt gebruikt om de ultrastructuur van cellen te bestuderen, zoals mitochondriën,
membranen en het endoplasmatisch reticulum. Hier is de resolutie extreem hoog, tot wel 0,1 nm,
waardoor zeer fijne details zichtbaar worden. In tegenstelling tot lichtmicroscopie werkt TEM met
een elektronenbundel in plaats van licht. Het beeld wordt gevormd doordat elektronen door het
ultradunne preparaat gaan en op een detector worden opgevangen; zones waar elektronen meer
worden tegengehouden verschijnen donkerder. Dit verklaart ook waarom de coupes zo ultradun
(50-100 nm) moeten zijn, elektronen moeten erdoor kunnen passeren.
Bij TEM is een zeer snelle en goede fixatie cruciaal, omdat het gerinste weefselverval al zichtbaar
wordt en de beoordeling sterk kan verstoren. Al enkele minuten na het verlies van
bloedvoorziening treedt osmotische zwelling van mitochondriën en endoplasmatisch reticulum op.
Daarom moeten weefselfragmenten klein zijn (max 1-2 mm) en snel worden gefixeerd met
gekoelde glutaaraldehyde (4°C). Daarna volgt een tweede fixatie met osmiumtretroxide (OsO₄) dat
lipiden bewaart en door zware metaalbinding extra contrast geeft. Vervolgens wordt het weefsel
gedehydrateerd en ingebed in epoxyhars, waarna ultradunne coupes worden gesneden met een
diamantmes. Op deze preparaten zorgt OsO₄ voor contrast: gebieden met veel OsO₄ houden meer
elektronen tegen en worden donker. Daarnaast kan immunogoudlabeling gebruikt worden om
specifieke moleculen zichtbaar te maken als zwarte puntjes.
1
,2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden
deze gebruikt?
Fixatie is een essentiële stap in de staalvoorbereiding voor histologie met als doel het weefsel
zo goed mogelijk te bewaren in zijn oorspronkelijke structurele en chemische toestand. Na
afname treden snel afbraakprocessen op door zuurstofgebrek, opstapeling van afvalstoffen
en vrijstellingen van lytische enzymen (bv. uit lysosomen). Ook micro-organismen kunnen het
weefsel aantasten via verteringsenzymen (oa. Proteasen). Fixatie remt deze processen en
stopt de microbiële groei.
Het basisprincipe van fixatie berust op onderdompeling van het weefsel in een fixator,
paproces, crosslinking, zorgt ervoor dat eiwitten onderling en met het cytoskelet verbonden
blijven, waardoor de morfologie behouden blijft. Tegelijk verliezen de meeste enzymen hun
activiteit. De fixatieduur varieert typisch van 2 tot 24 uur, afhankelijk van de grootte van het
weefsel, de gebruikte methode en de fixator. Het volume fixatief moet minstens vijfmaal het
weefselvolume bedragen.
Formaldehyde (meestal gebruikt als formol, een waterige oplossing) is de meest gebruikte
fixator in de lichtmicroscopie. Het veroorzaakt relatief milde crosslinking en heeft een goede
penetratie, waardoor het geschikt is voor grotere weefselstukken en routinegebruik.
Formaldehyde wordt gebruikt voor routinehistologie, zoals kleuringen met hematoxyline-
eosine (H&E); Daarnaast is het geschikt voor immunohistochemie op paraffinecoupes en
voor in situ hybridisatie, omdat de algemene structuur goed behouden blijft terwijl antigenen
vaak nog detecteerbaar zijn.
Voor elektronenmicroscopie is een snellere en sterkere fixatie vereist om ultrastructuren
optimaal te bewaren. Hiervoor wordt glutaraldehyde gebruikt, meestal bij lage temperatuur
(ongeveer 4°C). Glutaraldehyde vormt sterkere en uitgebreidere crosslinks dan
formaldehyde, wat leidt tot een uitstekende bewaring van subcellulaire structuren. Omdat
de penetratie trager verloopt, moeten weefselfragmenten klein zijn (1-2 mm). Deze fixatie
wordt vaak gevolgd door een tweede fixatie met osmiumtetroxide (OsO₄), dat lipiden fixeert
en elektrondensiteit toevoegt. Glutaraldehyde wordt voornamelijk gebruikt voor transmissie-
elektronenmicroscopie en in sommige gevallen ook voor rasterelektronenmicroscopie (REM)
2
, 3. Bespreek de algemene principes van immuunhistochemie. Waarom wordt er
gebruik gemaakt van directe, indirecte en ge-ampificeerde immunohistochemie?
Immunohistochemie is een techniek die gebruikt wordt om antigenen in weefselcoupes aan te tonen
en te lokaliseren met behulp van specifieke antistoffen. Antigenen zijn meestal eiwitten of
glycoproteïnen die zich extracellulair, op het membraan, in het cytoplasma of in de kern bevinden.
Antistoffen worden door het immuunsysteem geproduceerd en binden specifiek aan een bepaald
deel van het antigeen, het zogenaamde epitoop. Hierbij kan men onderscheid maken tussen
polyklonale stoffen (gericht tegen meerdere epitopen, maar minder specifiek en kans op
kruisreacties) en monoklonale antistoffen (gericht tegen één epitoop en dus specifieker).
Wanneer het doelantigeen aanwezig is in de coupe, vormt de antistof hiermee een imuuncomplex.
Dit complex is echter niet zichtbaar en daarom moet de antistof gebonden worden aan een enzym,
een fluorescerend molecule, biotine of goudpartikel.
Het succes van immuunhistochemie hangt af van enkele cruciale factoren. Affiniteit (bindingssterke),
specifiteit, sensitiviteit (detectie van kleine hoeveelheden antigeen) en de toegankelijkheid van
epitopen, die soms via antigen retrieval (warmte of enzymen) opnieuw zichtbaar worden gemaakt.
Er worden drie hoofdmethodes onderscheiden:
1. De directe methode is een éénstapsmethode waarbij de antistof zelf gelabeld. Deze
techniek is snel en eenvoudig, maar heeft een lage sensitiviteit omdat er geen
signaalversterking optreedt. Hierdoor zijn kleine hoeveelheden antigeen moeilijk
detecteerbaar. Deze methode wordt voornamelijk gebruikt om
immuunglobuline en complementdeposities op te sporen in huid- en
nierbiopten.
2. De indirecte methode is een tweestapsmethode. Hierbij is de primaire antistof niet gelabeld,
maar wordt een gelabelde secundaire antistof toegevoegd die bindt aan het Fc-fragment van
de primaire antistof. Deze methode heeft belangrijke voordelen:
Signaalversterking, doordat meerdere secundaire antistoffen kunnen binden aan één
primaire antistof → sterker signaal
Hogere sensitiviteit
Flexibiliteit, aangezien één type secundaire antistof gebruikt kan reageren met
meerdere primaire antistoffen
Lagere kostprijs, omdat minder primaire antistof nodig is
3. De ge-ampificeerde methode zorgt voor nog sterkere signaalversterking, vaak via het
biotine-streptavidine systeem. Biotine wordt aan de antistof gekoppeld, waarna
streptavidine (met enzym) hier zeer sterk aan bindt. Omdat streptavidine meerdere
bindingsplaatsen heeft, ontstaan grote complexen met veel enzymmoleculen, wat leidt tot
een zeer intens signaal en hoge sensitiviteit.
3
, 4. Welke verwerkingsstappen doorloopt een weefselstukje tussen resectie
tijdens operatie en diagnostiek middels lichtmicroscopie? Licht iedere stap
kort toe.
Tussen de resectie van een weefsel tijdens een operatie en de diagnostiek met de
lichtmicroscoop doorloopt het staal een aantal opeenvolgende verwerkingsstappen.
1. Bewaren en fixeren van het weefsel
Onmiddellijk na afname moet het weefsel bewaard worden om afbraak te voorkomen. Dit
gebeurt standaard door fixatie met een watergebaseerd fixatief, waarbij enzymen
geïnactiveerd worden en de weefselstructuur behouden blijft. Invriezen kan ook toegepast
worden,, maar dat is niet de standaardprocedure voor lichtmicroscopisch onderzoek.
2. Insluiten en voorbereiden voor snijden
Gefixeerd weefsel is nog te zacht om te snijden en moet daarom ingebed worden in paraffine.
Omdat fixatieven water bevatten en paraffine hydrofoob is, wordt het weefsel eerst
gedehydrateerd via oplopende alcoholreeks. Vervolgens wordt het alcohol vervangen door
een tussenstof zoals xyleen of tolueen, die mengbaar is met paraffine. Daarna wordt het
weefsel geïmpregneerd met vloeibare paraffine en gegoten tot een stevige paraffineblok.
3. Vervaardigen van coupes
Het paraffineblok wordt met een microtoom in dunne sneden (ongeveer 2-5 µm) gesneden.
Deze coupes worden op draagglaasjes aangebracht.
4. Ontparaffineren en rehydrateren
Voor het kleuren moet de paraffine verwijderd worden, omdat de meeste kleurstoffen
wateroplosbaar zijn. Om de paraffine te verwijderen wordt hetzelfde proces herhaald als bij
inbedden, maar nu in omgekeerde volgorde. Paraffine wordt opgelost met xyleen, vervolgens
wordt xyleen uit gespoeld met alcohol om het weefsel dan helemaal te rehydrateren met
water.
5. Kleuren van de coupes
De coupes worden vervolgens gekleurd (bv. met hematoxyline-eosine) zodat verschillende cel-
en weefselstructuren zichtbaar worden.
6. Afdekken
Tot slot wordt een dekglaasje aangebracht met een montagemedium, zodat het preparaat
beschermd is en geschikt voor microscopisch onderzoek.
Deze opeenvolgende stappen maken met mogelijk om de morfologie van het weefsel
betrouwbaar te beoordelen met de lichtmicroscoop.
4
Open vragen (leg uit aan de hand van een tekening en geef de nodige uitleg):
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie
elektronenmicroscopie (TEM). Wat kan je met beide technieken onderzoeken?
Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt worden voor deze methoden
en waarom?
Conventionele lichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie worden beide gebruikt om
weefsels en cellen te bestuderen, maar verschillen sterk in resolutie, beeldvorming en
staalvoorbereiding.
Met de lichtmicroscoop bestudeer je vooral de algemene cel- en weefselstructuur. Het maakt
gebruik van zichtbaar licht (fotonen). Je kan cellen, celkernen en grotere organellen herkennen en
de organisatie weefsels beoordelen, maar de resolutie in beperkt tot ongeveer 0,2 µm, waardoor
fijne ultrastructuren niet zichtbaar zijn. Voorbereiding van het weefsel omvat fixatie (meestal met
formol / formaldehyde) om afbraakprocessen te stoppen via crosslinking van eiwitten en zo de
structuur te bewaren. Daarna volgt dehydratie, inbedding in paraffine en het snijden van coupes
van 5-10 µm met een microtoom. Vervolgens worden de coupes gedeparaffineerd en gekleurd om
structuren zichtbaar te maken. Ook invriezen met OCT en cryocoupes is mogelijk voor bepaalde
toepassingen zoals immunokleuringen.
De TEM wordt gebruikt om de ultrastructuur van cellen te bestuderen, zoals mitochondriën,
membranen en het endoplasmatisch reticulum. Hier is de resolutie extreem hoog, tot wel 0,1 nm,
waardoor zeer fijne details zichtbaar worden. In tegenstelling tot lichtmicroscopie werkt TEM met
een elektronenbundel in plaats van licht. Het beeld wordt gevormd doordat elektronen door het
ultradunne preparaat gaan en op een detector worden opgevangen; zones waar elektronen meer
worden tegengehouden verschijnen donkerder. Dit verklaart ook waarom de coupes zo ultradun
(50-100 nm) moeten zijn, elektronen moeten erdoor kunnen passeren.
Bij TEM is een zeer snelle en goede fixatie cruciaal, omdat het gerinste weefselverval al zichtbaar
wordt en de beoordeling sterk kan verstoren. Al enkele minuten na het verlies van
bloedvoorziening treedt osmotische zwelling van mitochondriën en endoplasmatisch reticulum op.
Daarom moeten weefselfragmenten klein zijn (max 1-2 mm) en snel worden gefixeerd met
gekoelde glutaaraldehyde (4°C). Daarna volgt een tweede fixatie met osmiumtretroxide (OsO₄) dat
lipiden bewaart en door zware metaalbinding extra contrast geeft. Vervolgens wordt het weefsel
gedehydrateerd en ingebed in epoxyhars, waarna ultradunne coupes worden gesneden met een
diamantmes. Op deze preparaten zorgt OsO₄ voor contrast: gebieden met veel OsO₄ houden meer
elektronen tegen en worden donker. Daarnaast kan immunogoudlabeling gebruikt worden om
specifieke moleculen zichtbaar te maken als zwarte puntjes.
1
,2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden
deze gebruikt?
Fixatie is een essentiële stap in de staalvoorbereiding voor histologie met als doel het weefsel
zo goed mogelijk te bewaren in zijn oorspronkelijke structurele en chemische toestand. Na
afname treden snel afbraakprocessen op door zuurstofgebrek, opstapeling van afvalstoffen
en vrijstellingen van lytische enzymen (bv. uit lysosomen). Ook micro-organismen kunnen het
weefsel aantasten via verteringsenzymen (oa. Proteasen). Fixatie remt deze processen en
stopt de microbiële groei.
Het basisprincipe van fixatie berust op onderdompeling van het weefsel in een fixator,
paproces, crosslinking, zorgt ervoor dat eiwitten onderling en met het cytoskelet verbonden
blijven, waardoor de morfologie behouden blijft. Tegelijk verliezen de meeste enzymen hun
activiteit. De fixatieduur varieert typisch van 2 tot 24 uur, afhankelijk van de grootte van het
weefsel, de gebruikte methode en de fixator. Het volume fixatief moet minstens vijfmaal het
weefselvolume bedragen.
Formaldehyde (meestal gebruikt als formol, een waterige oplossing) is de meest gebruikte
fixator in de lichtmicroscopie. Het veroorzaakt relatief milde crosslinking en heeft een goede
penetratie, waardoor het geschikt is voor grotere weefselstukken en routinegebruik.
Formaldehyde wordt gebruikt voor routinehistologie, zoals kleuringen met hematoxyline-
eosine (H&E); Daarnaast is het geschikt voor immunohistochemie op paraffinecoupes en
voor in situ hybridisatie, omdat de algemene structuur goed behouden blijft terwijl antigenen
vaak nog detecteerbaar zijn.
Voor elektronenmicroscopie is een snellere en sterkere fixatie vereist om ultrastructuren
optimaal te bewaren. Hiervoor wordt glutaraldehyde gebruikt, meestal bij lage temperatuur
(ongeveer 4°C). Glutaraldehyde vormt sterkere en uitgebreidere crosslinks dan
formaldehyde, wat leidt tot een uitstekende bewaring van subcellulaire structuren. Omdat
de penetratie trager verloopt, moeten weefselfragmenten klein zijn (1-2 mm). Deze fixatie
wordt vaak gevolgd door een tweede fixatie met osmiumtetroxide (OsO₄), dat lipiden fixeert
en elektrondensiteit toevoegt. Glutaraldehyde wordt voornamelijk gebruikt voor transmissie-
elektronenmicroscopie en in sommige gevallen ook voor rasterelektronenmicroscopie (REM)
2
, 3. Bespreek de algemene principes van immuunhistochemie. Waarom wordt er
gebruik gemaakt van directe, indirecte en ge-ampificeerde immunohistochemie?
Immunohistochemie is een techniek die gebruikt wordt om antigenen in weefselcoupes aan te tonen
en te lokaliseren met behulp van specifieke antistoffen. Antigenen zijn meestal eiwitten of
glycoproteïnen die zich extracellulair, op het membraan, in het cytoplasma of in de kern bevinden.
Antistoffen worden door het immuunsysteem geproduceerd en binden specifiek aan een bepaald
deel van het antigeen, het zogenaamde epitoop. Hierbij kan men onderscheid maken tussen
polyklonale stoffen (gericht tegen meerdere epitopen, maar minder specifiek en kans op
kruisreacties) en monoklonale antistoffen (gericht tegen één epitoop en dus specifieker).
Wanneer het doelantigeen aanwezig is in de coupe, vormt de antistof hiermee een imuuncomplex.
Dit complex is echter niet zichtbaar en daarom moet de antistof gebonden worden aan een enzym,
een fluorescerend molecule, biotine of goudpartikel.
Het succes van immuunhistochemie hangt af van enkele cruciale factoren. Affiniteit (bindingssterke),
specifiteit, sensitiviteit (detectie van kleine hoeveelheden antigeen) en de toegankelijkheid van
epitopen, die soms via antigen retrieval (warmte of enzymen) opnieuw zichtbaar worden gemaakt.
Er worden drie hoofdmethodes onderscheiden:
1. De directe methode is een éénstapsmethode waarbij de antistof zelf gelabeld. Deze
techniek is snel en eenvoudig, maar heeft een lage sensitiviteit omdat er geen
signaalversterking optreedt. Hierdoor zijn kleine hoeveelheden antigeen moeilijk
detecteerbaar. Deze methode wordt voornamelijk gebruikt om
immuunglobuline en complementdeposities op te sporen in huid- en
nierbiopten.
2. De indirecte methode is een tweestapsmethode. Hierbij is de primaire antistof niet gelabeld,
maar wordt een gelabelde secundaire antistof toegevoegd die bindt aan het Fc-fragment van
de primaire antistof. Deze methode heeft belangrijke voordelen:
Signaalversterking, doordat meerdere secundaire antistoffen kunnen binden aan één
primaire antistof → sterker signaal
Hogere sensitiviteit
Flexibiliteit, aangezien één type secundaire antistof gebruikt kan reageren met
meerdere primaire antistoffen
Lagere kostprijs, omdat minder primaire antistof nodig is
3. De ge-ampificeerde methode zorgt voor nog sterkere signaalversterking, vaak via het
biotine-streptavidine systeem. Biotine wordt aan de antistof gekoppeld, waarna
streptavidine (met enzym) hier zeer sterk aan bindt. Omdat streptavidine meerdere
bindingsplaatsen heeft, ontstaan grote complexen met veel enzymmoleculen, wat leidt tot
een zeer intens signaal en hoge sensitiviteit.
3
, 4. Welke verwerkingsstappen doorloopt een weefselstukje tussen resectie
tijdens operatie en diagnostiek middels lichtmicroscopie? Licht iedere stap
kort toe.
Tussen de resectie van een weefsel tijdens een operatie en de diagnostiek met de
lichtmicroscoop doorloopt het staal een aantal opeenvolgende verwerkingsstappen.
1. Bewaren en fixeren van het weefsel
Onmiddellijk na afname moet het weefsel bewaard worden om afbraak te voorkomen. Dit
gebeurt standaard door fixatie met een watergebaseerd fixatief, waarbij enzymen
geïnactiveerd worden en de weefselstructuur behouden blijft. Invriezen kan ook toegepast
worden,, maar dat is niet de standaardprocedure voor lichtmicroscopisch onderzoek.
2. Insluiten en voorbereiden voor snijden
Gefixeerd weefsel is nog te zacht om te snijden en moet daarom ingebed worden in paraffine.
Omdat fixatieven water bevatten en paraffine hydrofoob is, wordt het weefsel eerst
gedehydrateerd via oplopende alcoholreeks. Vervolgens wordt het alcohol vervangen door
een tussenstof zoals xyleen of tolueen, die mengbaar is met paraffine. Daarna wordt het
weefsel geïmpregneerd met vloeibare paraffine en gegoten tot een stevige paraffineblok.
3. Vervaardigen van coupes
Het paraffineblok wordt met een microtoom in dunne sneden (ongeveer 2-5 µm) gesneden.
Deze coupes worden op draagglaasjes aangebracht.
4. Ontparaffineren en rehydrateren
Voor het kleuren moet de paraffine verwijderd worden, omdat de meeste kleurstoffen
wateroplosbaar zijn. Om de paraffine te verwijderen wordt hetzelfde proces herhaald als bij
inbedden, maar nu in omgekeerde volgorde. Paraffine wordt opgelost met xyleen, vervolgens
wordt xyleen uit gespoeld met alcohol om het weefsel dan helemaal te rehydrateren met
water.
5. Kleuren van de coupes
De coupes worden vervolgens gekleurd (bv. met hematoxyline-eosine) zodat verschillende cel-
en weefselstructuren zichtbaar worden.
6. Afdekken
Tot slot wordt een dekglaasje aangebracht met een montagemedium, zodat het preparaat
beschermd is en geschikt voor microscopisch onderzoek.
Deze opeenvolgende stappen maken met mogelijk om de morfologie van het weefsel
betrouwbaar te beoordelen met de lichtmicroscoop.
4
