Microscopische technieken
Functies microscoop:
• Een vergroot beeld van het specimen produceren (vergroting).
• De details in het beeld scheiden (resolutie).
• De details zichtbaar maken (contrast).
Grootte van cellen, klein naar groot:
• Eiwitten, 8 nm
• Ribosomen, 30 nm
• Mitochondriën, 1 micrometer
• Kern, 4 micrometer
• Rode bloedcel, 8 micrometer
• Cel, 10 micrometer
Resolutie: oplossend vermogen, kleinste afstand waarmee 2 punten nog net gescheiden worden
weergeven.
• Resolutie lichtmicroscoop 0,2 micrometer
• Resolutie oog 0,2 mm
• Resolutie elektronenmicroscoop 0,1 nanometer
D = λ / 2n sinα
• N is de brekingsindex
• D is resolutie
• Α is de halve tophoek van de apertuurkegel
o Apertuurkegel: waar het licht op de lens invalt.
• Waarde noemer is maximaal 0,95, behalve als er water of olie etc wordt toegevoegd.
Vergroting microscoop = objectief X oculair
De samengestelde lichtmicroscoop
• Optiek: 3 lenssystemen
o Oculair: vergroting beeld, projectie op netvlies
o Objectief: vormt tussenbeeld en bepaalt grotendeels de vergroting
o Condensor: herleidt het licht tot een smalle lichtbundel, zo word alleen het
preparaat belicht.
• Statief, preparaattafel, lichtbron, diafragma’s.
,Lenstheorie
Licht afkomstig van een object dat ver verwijderd is van de voorkant van een convex e lens, zal
scherp gesteld worden op een vast punt achter de lens: het focaal punt.
Afstand tussen centrum van enkelvoudige convexe lens en het vocaal: focale afstand.
Verticaal vlak waarin het vocaal punt ligt: focaal vlak
Het beeld van het object verschijnt in het focaal vlak, deze is kleiner en omgekeerd, het is een ECHT
beeld.
1:1-fotografie: het object bevindt zich op tweemaal de focale afstand, het beeld is nu de identieke
grootte van het object.
Als het object tussen 1 en 2x de focale lengte zit wordt het beeld vergroot, dit wordt gebruikt bij
microscopie.
Wanneer het object zich op het voorste focaal vlak van de lens bevindt, zullen de lichtstralen
evenwijdig de lens verlaten. Als het beeld dan wordt scherp gesteld door het oog bevindt zich dit a an
dezelfde kant van de lens en wordt het rechtop waargenomen, het is een virtueel beeld.
Bij een microscoop wordt het object gepositioneerd op het voorste focaal vlak van het objectief, het
object wordt waargenomen op ongeveer 25 cm van het oog.
,Weefselvoorbereiding: fixatie
Het orgaan of weefsel dat voor onderzoek wordt geselecteerd, wordt uit het dier verwijderd en
gefixeerd door perfusie (via de bloedbaan) of immersie (onderdompelen). Degradatie wordt zo
tegengegaan doordat er cross-links ontstaan tussen het fixatie en de aanwezige biomoleculen.
• Met als chemische fixatieven: paraformaldehyde of glutaaraldehyde.
Volgende stappen: spoelen --> dehydrateren in baden van ethanol --> inbedden in paraffine.
Het met paraffine geïmpregneerde weefselblokje wordt in de houder van een microtoom geplaatst,
deze snijdt het in dunne schijfjes (coupe/weefselsnede) van 2 tot 7 micrometer dik.
Volgende stappen: coupe op draagglaasje --> deparaffineren met xyleen --> in waterig milieu
brengen --> kleuren.
Kleuring is noodzakelijk om contrast te krijgen, niet gekleurd weefsel heeft namelijk dezelfde
brekingsindex als glas.
• HE: bestaat uit hematoxyline (basisch) en eosine (zuur).
Na kleuring wordt de coupe opnieuw gedehydrateerd, dan ingesloten in een niet-waterig
inbeddingsmedium om uitdroging te voorkomen.
Fasecontrastmicroscopie
Lichtgolven die door een preparaat heen gaan verschillen niet in amplitude (intensiteit) maar alleen
in fase. Het oog kan alleen verschillen in intensiteit waarnemen, faseverschillen zijn onzichtbaar.
De fasecontrasttechniek: kunstmatige helderheidsverschillen worden aangebracht op de plaats van
de faseverschillen.
Vooral nuttig bij levende cellen, aangezien een aantal kleurstoffen duidelijke cytotoxische
eigenschappen hebben.
, Donkerveldmicroscopie
Er valt geen licht in het objectief direct uit de condensor komend, alleen het door het
objectstructuur afgebogen en verstrooide licht levert een bijdrage aan de beeldvorming.
Door donkerveldcondensoren en een sterke lichtbron te gebruiken kunnen ook zwak licht-
verstrooiende objecten gebruikt worden.
De techniek laat toe om levende cellen te bestuderen.
Polarisatiemicroscopie
Wordt gebruikt als objecten repeterende structuren hebben. Als normale preparaten tussen twee
gekruiste polarisatoren worden geplaatst zal het beeld donker blijven, maar met bijvoorbeeld
ongekleurd skeletspierweefsel zullen donkere en lichte banden te zien zijn. Het biomedische
toepassingsgebied is beperkt.
Differentiaal-interferentie-contrast (DIC)
Wordt gebruikt bij dikkere preparaten met grotere brekingsindexverschillen. Maakt gebruikt van
principes van polarisatiemicroscopie.
Functies microscoop:
• Een vergroot beeld van het specimen produceren (vergroting).
• De details in het beeld scheiden (resolutie).
• De details zichtbaar maken (contrast).
Grootte van cellen, klein naar groot:
• Eiwitten, 8 nm
• Ribosomen, 30 nm
• Mitochondriën, 1 micrometer
• Kern, 4 micrometer
• Rode bloedcel, 8 micrometer
• Cel, 10 micrometer
Resolutie: oplossend vermogen, kleinste afstand waarmee 2 punten nog net gescheiden worden
weergeven.
• Resolutie lichtmicroscoop 0,2 micrometer
• Resolutie oog 0,2 mm
• Resolutie elektronenmicroscoop 0,1 nanometer
D = λ / 2n sinα
• N is de brekingsindex
• D is resolutie
• Α is de halve tophoek van de apertuurkegel
o Apertuurkegel: waar het licht op de lens invalt.
• Waarde noemer is maximaal 0,95, behalve als er water of olie etc wordt toegevoegd.
Vergroting microscoop = objectief X oculair
De samengestelde lichtmicroscoop
• Optiek: 3 lenssystemen
o Oculair: vergroting beeld, projectie op netvlies
o Objectief: vormt tussenbeeld en bepaalt grotendeels de vergroting
o Condensor: herleidt het licht tot een smalle lichtbundel, zo word alleen het
preparaat belicht.
• Statief, preparaattafel, lichtbron, diafragma’s.
,Lenstheorie
Licht afkomstig van een object dat ver verwijderd is van de voorkant van een convex e lens, zal
scherp gesteld worden op een vast punt achter de lens: het focaal punt.
Afstand tussen centrum van enkelvoudige convexe lens en het vocaal: focale afstand.
Verticaal vlak waarin het vocaal punt ligt: focaal vlak
Het beeld van het object verschijnt in het focaal vlak, deze is kleiner en omgekeerd, het is een ECHT
beeld.
1:1-fotografie: het object bevindt zich op tweemaal de focale afstand, het beeld is nu de identieke
grootte van het object.
Als het object tussen 1 en 2x de focale lengte zit wordt het beeld vergroot, dit wordt gebruikt bij
microscopie.
Wanneer het object zich op het voorste focaal vlak van de lens bevindt, zullen de lichtstralen
evenwijdig de lens verlaten. Als het beeld dan wordt scherp gesteld door het oog bevindt zich dit a an
dezelfde kant van de lens en wordt het rechtop waargenomen, het is een virtueel beeld.
Bij een microscoop wordt het object gepositioneerd op het voorste focaal vlak van het objectief, het
object wordt waargenomen op ongeveer 25 cm van het oog.
,Weefselvoorbereiding: fixatie
Het orgaan of weefsel dat voor onderzoek wordt geselecteerd, wordt uit het dier verwijderd en
gefixeerd door perfusie (via de bloedbaan) of immersie (onderdompelen). Degradatie wordt zo
tegengegaan doordat er cross-links ontstaan tussen het fixatie en de aanwezige biomoleculen.
• Met als chemische fixatieven: paraformaldehyde of glutaaraldehyde.
Volgende stappen: spoelen --> dehydrateren in baden van ethanol --> inbedden in paraffine.
Het met paraffine geïmpregneerde weefselblokje wordt in de houder van een microtoom geplaatst,
deze snijdt het in dunne schijfjes (coupe/weefselsnede) van 2 tot 7 micrometer dik.
Volgende stappen: coupe op draagglaasje --> deparaffineren met xyleen --> in waterig milieu
brengen --> kleuren.
Kleuring is noodzakelijk om contrast te krijgen, niet gekleurd weefsel heeft namelijk dezelfde
brekingsindex als glas.
• HE: bestaat uit hematoxyline (basisch) en eosine (zuur).
Na kleuring wordt de coupe opnieuw gedehydrateerd, dan ingesloten in een niet-waterig
inbeddingsmedium om uitdroging te voorkomen.
Fasecontrastmicroscopie
Lichtgolven die door een preparaat heen gaan verschillen niet in amplitude (intensiteit) maar alleen
in fase. Het oog kan alleen verschillen in intensiteit waarnemen, faseverschillen zijn onzichtbaar.
De fasecontrasttechniek: kunstmatige helderheidsverschillen worden aangebracht op de plaats van
de faseverschillen.
Vooral nuttig bij levende cellen, aangezien een aantal kleurstoffen duidelijke cytotoxische
eigenschappen hebben.
, Donkerveldmicroscopie
Er valt geen licht in het objectief direct uit de condensor komend, alleen het door het
objectstructuur afgebogen en verstrooide licht levert een bijdrage aan de beeldvorming.
Door donkerveldcondensoren en een sterke lichtbron te gebruiken kunnen ook zwak licht-
verstrooiende objecten gebruikt worden.
De techniek laat toe om levende cellen te bestuderen.
Polarisatiemicroscopie
Wordt gebruikt als objecten repeterende structuren hebben. Als normale preparaten tussen twee
gekruiste polarisatoren worden geplaatst zal het beeld donker blijven, maar met bijvoorbeeld
ongekleurd skeletspierweefsel zullen donkere en lichte banden te zien zijn. Het biomedische
toepassingsgebied is beperkt.
Differentiaal-interferentie-contrast (DIC)
Wordt gebruikt bij dikkere preparaten met grotere brekingsindexverschillen. Maakt gebruikt van
principes van polarisatiemicroscopie.
