INHOUDSOPGAVE
1. Reversed genetics: van proteine naar cDNA (Gettemans)............................................................................. 4
2. Nanobodies (Gettemans)............................................................................................................................ 6
2.1. Inleiding antilichamen .....................................................................................................................................6
2.2. Inleiding nanobodies .......................................................................................................................................7
2.3. Nanobodies als geneesmiddel en eigenschappen ............................................................................................8
2.4. Structuur van nanobodies ...............................................................................................................................9
2.5. Ontwikkeling van nanobodies ..........................................................................................................................9
2.6. Toepassingen van nanobodies....................................................................................................................... 10
2.7. nanobodies als molecular rovers ................................................................................................................... 11
2.8. Nanobodies in structurele biologie ................................................................................................................ 11
2.9. Nanobodies in orphan diseases ..................................................................................................................... 12
2.10. AAV als delivery systeem voor nanobodies.................................................................................................. 14
2.11. nanobody lipid nanopartikels ..................................................................................................................... 15
3.12. CAR-T therapie .......................................................................................................................................... 17
3.13. Concatenatie van nanobodies ................................................................................................................... 18
3. Stamcellen (Heindryckx) .......................................................................................................................... 18
3.1. Cultuurspecifieke celtypes ............................................................................................................................ 18
3.2. Gespecialiseerde celsystemen...................................................................................................................... 20
3.3. Stamcellen in cel- en weefselcultuur ............................................................................................................. 21
3.4. Induced pluripotent stem cells (iPSC) ............................................................................................................ 24
3.5. Artificiële embryo’s ....................................................................................................................................... 24
3.5.1. Artificiële muis embryo’s ....................................................................................................................... 24
3.5.2. Artificiële humane embryo’s .................................................................................................................. 25
3.5.3. Artificiële gameten................................................................................................................................. 25
3.6. Klinische toepassingen van pluripotente stamcellen ...................................................................................... 25
4. Massive parallel sequencing (Coppieters) ................................................................................................. 26
4.1. Introductie ................................................................................................................................................... 26
4.2. Short-read sequencing .................................................................................................................................. 27
4.2.1. sequencing-by-synthesis (SBS) .............................................................................................................. 27
4.2.2. Library prep methods and applications ................................................................................................... 28
4.3. Long-read sequencing................................................................................................................................... 31
4.3.1. Sequencing techniques ......................................................................................................................... 31
4.3.2. Applications .......................................................................................................................................... 33
5. Genetherapy for inherited diseases (Coppieters) ....................................................................................... 34
5.1. Ex vivo gene therapy ...................................................................................................................................... 34
5.2. In vivo gene therapy ...................................................................................................................................... 34
5.2.1. Overview of different gene therapy strategies .......................................................................................... 34
1
, 5.2.2. Gene augmentation ............................................................................................................................... 35
5.2.3. Gene editing .......................................................................................................................................... 37
5.2.4. Antisense oligonucleotides .................................................................................................................... 38
6. Basis celcultuur (Hendrix) ........................................................................................................................ 39
6.1. Historiek ...................................................................................................................................................... 39
6.2. Voordelen en beperkingen cel- en weefselculturen......................................................................................... 40
6.3. Cultuurmedia ............................................................................................................................................... 41
6.4. Celcultuur recipiënten .................................................................................................................................. 43
6.5. Het celcultuurlabo ........................................................................................................................................ 44
6.6. Celeigenschappen ........................................................................................................................................ 46
6.7. Subcultivatie ................................................................................................................................................ 46
6.8. Cel isolatie – starten nieuwe cultuur .............................................................................................................. 48
6.9. Cryopreservatie ............................................................................................................................................ 49
6.10. Sterilisatie en desinfectie ........................................................................................................................... 50
6.11. Karakterisering van cellijnen ...................................................................................................................... 53
7. Celassays (Hendrix) ................................................................................................................................. 54
7.1. Cel viabiliteit/ proliferatie .............................................................................................................................. 54
7.2. Monitoring .................................................................................................................................................... 56
7.3. Celdood ....................................................................................................................................................... 57
7.4. Senescentie ................................................................................................................................................. 58
7.5. Functionele assay’s ...................................................................................................................................... 58
7.6. Dosis-respons curve ..................................................................................................................................... 59
8. Secretoom: EVs (Hendrix) ......................................................................................................................... 60
9. DNA-gerelateerde technieken (Gettemans) ............................................................................................... 60
9.1. Uitvoeren van grootschalige mutagenese studies (eiwit engineering) ............................................................... 60
9.2. DNA shuffling ............................................................................................................................................... 61
9.2.1. Toepassingen van DNA shuffling: directed evolution ............................................................................... 62
10. Recombinante DNA-technologie (Eyckerman) ........................................................................................... 63
10.1. Wat is gentechnologie?.............................................................................................................................. 63
10.2. PCR .......................................................................................................................................................... 63
10.2.1. Klassieke PCR: amplificatie ................................................................................................................ 63
10.2.2. PCR mutagenese: overlap PCR ........................................................................................................... 64
10.3. CLoning strategieën .................................................................................................................................. 66
10.3.1. Klassieke cut-paste cloning ................................................................................................................ 66
10.3.2. Moderne cloning technieken............................................................................................................... 67
10.4. Soorten cloningvectoren ............................................................................................................................ 70
10.4.1. Bacteriële en Gist cloning vectors ....................................................................................................... 71
10.4.2. Virale vectoren ................................................................................................................................... 71
10.5. Toepassingen van recombinante DNA-technologie ..................................................................................... 73
2
,11. Genome editing door CRISPR/Cas9 technologie (Eyckerman) .................................................................... 74
11.1. Basisprincipes van genome editing ............................................................................................................ 74
11.2. CRISPR/Cas9 ............................................................................................................................................ 75
11.3. Detectie en karakterisering van genome editing .......................................................................................... 78
11.4. CRISPR/Cas9 knock-out met HDR.............................................................................................................. 78
11.5. Toepassingen van CRISPR/Cas9 ................................................................................................................ 79
11.6. Potentiële toepassingen van CRISPR/Cas9 ................................................................................................. 80
11.6.1. Potentiële toepassingen ..................................................................................................................... 80
11.6.2. CRISPR/Cas9 in actueel onderzoek in vivo........................................................................................... 81
11.6.3. CRISPR in mensen? ............................................................................................................................ 83
3
, GEN- EN CELTECHNOLOGIE
1. REVERSED GENETICS: VAN PROTEINE NAAR CDNA (GETTEMANS)
Reversed genetics = vertrekkende van kennis van een eiwit terugkeren naar het volledige cDNA
Start: eiwit gezuiverd via chromatografische technieken
1. Proteolyse met trypsine (X-B-Y, splitsing na B, B = Lys of Arg en Y ≠ Pro)
- Eiwit klieven in peptiden
- Laatste AZ van peptiden altijd Arg of Lys bij trypsine
2. Aminozuursequentie bepalen
- Eiwitten in databanken bekijken en stukken vergelijken met bekende eiwitten
- Peptiden vergelijken met databankstructuren
3. Oligo: geschikt peptide zoeken dat weinig degeneratie heeft in genetische code
- Degeneratie = meerdere codons coderen voor hetzelfde aminozuur, dus je
kent code niet als je AZ kent
- Je wil zo min mogelijk degeneratie in peptide: dan ben je zekerder van de sequentie van primers in het
mengsel => anders allemaal primers met verschillende sequenties
- Vb. Met en Trp = 1 codon (minste degeneratie)
- Vb. Arg, Leu en Ser = 6 codons (meeste degeneratie)
Oefening:
- Degeneratie < 1000 (dus voorbeeld = te hoge degeneratie)
- Alle peptiden afgaan en 2 met laagste degeneratie vinden
=> als primer gebruiken
- Je mag AZ van het C- of N-terminale deel laten vallen bij een peptide als
die voor te veel degeneratie zorgen, maar het peptide moet lang genoeg
zijn (minstens 7-9 AZ) om niet aspecifiek te zijn
- Je mag nooit een intern AZ verwijderen
Resultaat: 2 primers waarmee PCR uitgevoerd kan worden => welke hoe reverse primer maken?
- Primer 1 (P1) = forward primer
- Primer 2 (P2) => complement van P2 nemen en omdraaien (beginnen bij 5’) = reverse primer
Opmerking: willekeurig => als je pech hebt, ligt P2 eigenlijk voor P1 in de sequentie en zal je PCR dus mislukken (dan had
je P2 de forward primer en P1 de reverse primer moeten maken) => 50% van PCR’s mislukt dus in praktijk
Examen: als je de primers weergeeft, moet je de oriëntatie erbij schrijven!
ð Vb.
Resultaat PCR: gekend stuk cDNA verkregen (sequencing PCR-producten), maar 3’ en 5’ ontbreken nog
- 5’ en 3’ RACE uitvoeren om ontbrekende delen te verkrijgen
- RACE = rapid amplification of cDNA Ends
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1. Reversed genetics: van proteine naar cDNA (Gettemans)............................................................................. 4
2. Nanobodies (Gettemans)............................................................................................................................ 6
2.1. Inleiding antilichamen .....................................................................................................................................6
2.2. Inleiding nanobodies .......................................................................................................................................7
2.3. Nanobodies als geneesmiddel en eigenschappen ............................................................................................8
2.4. Structuur van nanobodies ...............................................................................................................................9
2.5. Ontwikkeling van nanobodies ..........................................................................................................................9
2.6. Toepassingen van nanobodies....................................................................................................................... 10
2.7. nanobodies als molecular rovers ................................................................................................................... 11
2.8. Nanobodies in structurele biologie ................................................................................................................ 11
2.9. Nanobodies in orphan diseases ..................................................................................................................... 12
2.10. AAV als delivery systeem voor nanobodies.................................................................................................. 14
2.11. nanobody lipid nanopartikels ..................................................................................................................... 15
3.12. CAR-T therapie .......................................................................................................................................... 17
3.13. Concatenatie van nanobodies ................................................................................................................... 18
3. Stamcellen (Heindryckx) .......................................................................................................................... 18
3.1. Cultuurspecifieke celtypes ............................................................................................................................ 18
3.2. Gespecialiseerde celsystemen...................................................................................................................... 20
3.3. Stamcellen in cel- en weefselcultuur ............................................................................................................. 21
3.4. Induced pluripotent stem cells (iPSC) ............................................................................................................ 24
3.5. Artificiële embryo’s ....................................................................................................................................... 24
3.5.1. Artificiële muis embryo’s ....................................................................................................................... 24
3.5.2. Artificiële humane embryo’s .................................................................................................................. 25
3.5.3. Artificiële gameten................................................................................................................................. 25
3.6. Klinische toepassingen van pluripotente stamcellen ...................................................................................... 25
4. Massive parallel sequencing (Coppieters) ................................................................................................. 26
4.1. Introductie ................................................................................................................................................... 26
4.2. Short-read sequencing .................................................................................................................................. 27
4.2.1. sequencing-by-synthesis (SBS) .............................................................................................................. 27
4.2.2. Library prep methods and applications ................................................................................................... 28
4.3. Long-read sequencing................................................................................................................................... 31
4.3.1. Sequencing techniques ......................................................................................................................... 31
4.3.2. Applications .......................................................................................................................................... 33
5. Genetherapy for inherited diseases (Coppieters) ....................................................................................... 34
5.1. Ex vivo gene therapy ...................................................................................................................................... 34
5.2. In vivo gene therapy ...................................................................................................................................... 34
5.2.1. Overview of different gene therapy strategies .......................................................................................... 34
1
, 5.2.2. Gene augmentation ............................................................................................................................... 35
5.2.3. Gene editing .......................................................................................................................................... 37
5.2.4. Antisense oligonucleotides .................................................................................................................... 38
6. Basis celcultuur (Hendrix) ........................................................................................................................ 39
6.1. Historiek ...................................................................................................................................................... 39
6.2. Voordelen en beperkingen cel- en weefselculturen......................................................................................... 40
6.3. Cultuurmedia ............................................................................................................................................... 41
6.4. Celcultuur recipiënten .................................................................................................................................. 43
6.5. Het celcultuurlabo ........................................................................................................................................ 44
6.6. Celeigenschappen ........................................................................................................................................ 46
6.7. Subcultivatie ................................................................................................................................................ 46
6.8. Cel isolatie – starten nieuwe cultuur .............................................................................................................. 48
6.9. Cryopreservatie ............................................................................................................................................ 49
6.10. Sterilisatie en desinfectie ........................................................................................................................... 50
6.11. Karakterisering van cellijnen ...................................................................................................................... 53
7. Celassays (Hendrix) ................................................................................................................................. 54
7.1. Cel viabiliteit/ proliferatie .............................................................................................................................. 54
7.2. Monitoring .................................................................................................................................................... 56
7.3. Celdood ....................................................................................................................................................... 57
7.4. Senescentie ................................................................................................................................................. 58
7.5. Functionele assay’s ...................................................................................................................................... 58
7.6. Dosis-respons curve ..................................................................................................................................... 59
8. Secretoom: EVs (Hendrix) ......................................................................................................................... 60
9. DNA-gerelateerde technieken (Gettemans) ............................................................................................... 60
9.1. Uitvoeren van grootschalige mutagenese studies (eiwit engineering) ............................................................... 60
9.2. DNA shuffling ............................................................................................................................................... 61
9.2.1. Toepassingen van DNA shuffling: directed evolution ............................................................................... 62
10. Recombinante DNA-technologie (Eyckerman) ........................................................................................... 63
10.1. Wat is gentechnologie?.............................................................................................................................. 63
10.2. PCR .......................................................................................................................................................... 63
10.2.1. Klassieke PCR: amplificatie ................................................................................................................ 63
10.2.2. PCR mutagenese: overlap PCR ........................................................................................................... 64
10.3. CLoning strategieën .................................................................................................................................. 66
10.3.1. Klassieke cut-paste cloning ................................................................................................................ 66
10.3.2. Moderne cloning technieken............................................................................................................... 67
10.4. Soorten cloningvectoren ............................................................................................................................ 70
10.4.1. Bacteriële en Gist cloning vectors ....................................................................................................... 71
10.4.2. Virale vectoren ................................................................................................................................... 71
10.5. Toepassingen van recombinante DNA-technologie ..................................................................................... 73
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,11. Genome editing door CRISPR/Cas9 technologie (Eyckerman) .................................................................... 74
11.1. Basisprincipes van genome editing ............................................................................................................ 74
11.2. CRISPR/Cas9 ............................................................................................................................................ 75
11.3. Detectie en karakterisering van genome editing .......................................................................................... 78
11.4. CRISPR/Cas9 knock-out met HDR.............................................................................................................. 78
11.5. Toepassingen van CRISPR/Cas9 ................................................................................................................ 79
11.6. Potentiële toepassingen van CRISPR/Cas9 ................................................................................................. 80
11.6.1. Potentiële toepassingen ..................................................................................................................... 80
11.6.2. CRISPR/Cas9 in actueel onderzoek in vivo........................................................................................... 81
11.6.3. CRISPR in mensen? ............................................................................................................................ 83
3
, GEN- EN CELTECHNOLOGIE
1. REVERSED GENETICS: VAN PROTEINE NAAR CDNA (GETTEMANS)
Reversed genetics = vertrekkende van kennis van een eiwit terugkeren naar het volledige cDNA
Start: eiwit gezuiverd via chromatografische technieken
1. Proteolyse met trypsine (X-B-Y, splitsing na B, B = Lys of Arg en Y ≠ Pro)
- Eiwit klieven in peptiden
- Laatste AZ van peptiden altijd Arg of Lys bij trypsine
2. Aminozuursequentie bepalen
- Eiwitten in databanken bekijken en stukken vergelijken met bekende eiwitten
- Peptiden vergelijken met databankstructuren
3. Oligo: geschikt peptide zoeken dat weinig degeneratie heeft in genetische code
- Degeneratie = meerdere codons coderen voor hetzelfde aminozuur, dus je
kent code niet als je AZ kent
- Je wil zo min mogelijk degeneratie in peptide: dan ben je zekerder van de sequentie van primers in het
mengsel => anders allemaal primers met verschillende sequenties
- Vb. Met en Trp = 1 codon (minste degeneratie)
- Vb. Arg, Leu en Ser = 6 codons (meeste degeneratie)
Oefening:
- Degeneratie < 1000 (dus voorbeeld = te hoge degeneratie)
- Alle peptiden afgaan en 2 met laagste degeneratie vinden
=> als primer gebruiken
- Je mag AZ van het C- of N-terminale deel laten vallen bij een peptide als
die voor te veel degeneratie zorgen, maar het peptide moet lang genoeg
zijn (minstens 7-9 AZ) om niet aspecifiek te zijn
- Je mag nooit een intern AZ verwijderen
Resultaat: 2 primers waarmee PCR uitgevoerd kan worden => welke hoe reverse primer maken?
- Primer 1 (P1) = forward primer
- Primer 2 (P2) => complement van P2 nemen en omdraaien (beginnen bij 5’) = reverse primer
Opmerking: willekeurig => als je pech hebt, ligt P2 eigenlijk voor P1 in de sequentie en zal je PCR dus mislukken (dan had
je P2 de forward primer en P1 de reverse primer moeten maken) => 50% van PCR’s mislukt dus in praktijk
Examen: als je de primers weergeeft, moet je de oriëntatie erbij schrijven!
ð Vb.
Resultaat PCR: gekend stuk cDNA verkregen (sequencing PCR-producten), maar 3’ en 5’ ontbreken nog
- 5’ en 3’ RACE uitvoeren om ontbrekende delen te verkrijgen
- RACE = rapid amplification of cDNA Ends
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