,BIOTECHNOLOGIE
2FBT – AJ 2025-26
, BIOTECHNOLOGIE
H1 DNA verkrijgen – recombinant technologie
Hoofdvraag: hoe krijgen we vreemd DNA in de gastheercel?
STAPPEN:
1. DNA knippen (met RE)
2. DNA plakken (in vector + ligase)
3. Bacterie binnen
4. Selecteren
1. vector & insert
Insert = doel DNA
Vector = een transportmiddel om een bepaalde stukje genetisch materiaal over te brengen naar
de gastheercel.
• Meestal plasmide/ bacteriofaag
• OriC
• MCS/ polylinker = gebied in de vector met unieke restrictie-enzym knipplaatsen
• Niet mobiliseerbaar: vaak geen loci aanwezig -> ongewenste verspreiding voorkomen
• Functionaliteit:
- expressievectoren: sterke promotors & ribosoombindingsplaatsen → gekloneerde gen
tot expressie brengen
- fagemiden: combi eigenschappen plasmiden & fagen
- shuttle vectoren: in meerdere soorten gastheren functioneren
2. Knippen met Restrictie-enzymen
= restrictie-endonuclease: herkennen en knippen specifieke sequenties → compatibele
uiteinden.
• Sticky ends
= asymmetrische knip -> 3’of 5’ overhangende uiteindes
>< blunt ends (stompe uiteindes)
= op exact dezelfde plaats -> geen overhang
• Isoschizomeren: herkennen + knippen dezelfde sequentie
• Neoschizomeren: herkennen zelfde sequentie -> knippen op andere plaats
• Isocaudomeren: herkennen ≠ sequentie -> produceren zelfde overhangende uiteindes
3. Plakken met Ligase
→ herstelt fosfodiësterbindingen in de DNA-ruggengraat
Reactiemechanisme
1. Zelf-adenylering
→ Ligase bindt op AMP groep in lysine residu in actieve centrum
2. Activatie
→ Adenylgroep overgedragen naar DNA 5’ P-uiteinde
3. Verzegeling
, BIOTECHNOLOGIE
→ 3’ OH-groep van andere streng valt 5’ P uiteinde aan en vormt covalente binding
→ AMP vrijgezet
Voorkomen van zelfligatie → fosfatasebehandeling !
= fosfaatgroepen op overhanguiteindes van vector hydrolyseren → geen zelfsluiting meer
mogelijk.
• BAP (=bacterial alkalin phosphatase)
• CIP (=calf intestinal mucosal alkalin phosphatase)
Opmerking: NIET bij gerichte klonering -> hebben geen compatibele uiteindes dus geen
zelfligatie
4. Transformatie
= verkregen recombinante construct in een levende gastheercel (meestal E. coli) brengen.
E. coli -> kan geen ‘naakt’ DNA opnemen -> COMPETENTE CELLEN maken!
Competente cellen maken
Chemische transformatie >< Fysische transformatie
CaCl2-hitteshock elektroporatie
* logfase!
1. ijskoude, hypotonische CaCl2-opl. 1. Sterk elektrisch veld
→ zwellen op (sferoplasten) → membraan polariseert + desoriëntatie
→ neutralisatie – lading van DNA mol. Lipide dubbellaag
en celmembraan → ontstaan van watergevulde poriën
→ Ca2+-DNA-complex → bescherming
DNasen voordeel: hogere transformatie efficiëntie
2. hitteshock (30-90s; 42°C)
→ ontstaan van poriën → DNA naar binnen
3. herstelfase
→ 1u – 37°C al schuddend
Doel:
1. Herstellen van beschadigde celmembraan en celwand
2. Aanrijking: cellen herstellen en prolifereren
3. Genexpressie
, BIOTECHNOLOGIE
5. Selectie
Genetisch materiaal succesvol opgenomen?
→ selectiemerkers: aanwezig op vector aanwezig (bv. antibioticaresistentie-genen)
Blauw-wit screening
α-COMPLEMENTATIE
1. Gastheercel: missen het α-deel van lacZ gen
2. Vector: met het lacZ α -fragment
Succesvol insert? lacZ α-gen verstoord = inactief enzym
MEDIUM
• Antibioticum: selectie van cellen die vector opgenomen hebben (met EN zonder insert)
• IPTG = inductor lac-operon
• X-GAL = chromogeen substraat → + β-galactosidase → hydrolyse blauw pigment
>> BLAUWE KOLONIES: geen insert (lege vector)
>> WITTE KOLONIES: insert aanwezig
H2 DNA opzuiveren
Hoofdvraag: Hoe krijgen we zuiver DNA/ RNA?
STAPPEN:
1. Cel lyseren
2. Onzuiverheden (bv. eiwitten) verwijderen
3. DNA concentreren
4. DNA analyseren/ bewaren
1. Lyseren
= openbreken van de cel zodat al het materiaal (incl. het DNA) vrijkomt
EDTA
• = chelerend agens (bevat metaalionen zoals Mg2+ en Ca2+)
• Doel:
>> beschermen tegen nuclease activiteit: Mg2 is een co-factor van endonucleasen
→ EDTA vangt deze → geen nuclease activiteit meer
>> verzwakken van celwand: Ca2+ neutraliseert – lading van het membraan
SDS = natriumdodecylsulfaat
• Anionisch
• Doel:
>> membraan oplossen: lipide-eiwit interacties verbreken
>> denaturatie van eiwitten: - lading zorgt voor ontvouwen van eiwit
2FBT – AJ 2025-26
, BIOTECHNOLOGIE
H1 DNA verkrijgen – recombinant technologie
Hoofdvraag: hoe krijgen we vreemd DNA in de gastheercel?
STAPPEN:
1. DNA knippen (met RE)
2. DNA plakken (in vector + ligase)
3. Bacterie binnen
4. Selecteren
1. vector & insert
Insert = doel DNA
Vector = een transportmiddel om een bepaalde stukje genetisch materiaal over te brengen naar
de gastheercel.
• Meestal plasmide/ bacteriofaag
• OriC
• MCS/ polylinker = gebied in de vector met unieke restrictie-enzym knipplaatsen
• Niet mobiliseerbaar: vaak geen loci aanwezig -> ongewenste verspreiding voorkomen
• Functionaliteit:
- expressievectoren: sterke promotors & ribosoombindingsplaatsen → gekloneerde gen
tot expressie brengen
- fagemiden: combi eigenschappen plasmiden & fagen
- shuttle vectoren: in meerdere soorten gastheren functioneren
2. Knippen met Restrictie-enzymen
= restrictie-endonuclease: herkennen en knippen specifieke sequenties → compatibele
uiteinden.
• Sticky ends
= asymmetrische knip -> 3’of 5’ overhangende uiteindes
>< blunt ends (stompe uiteindes)
= op exact dezelfde plaats -> geen overhang
• Isoschizomeren: herkennen + knippen dezelfde sequentie
• Neoschizomeren: herkennen zelfde sequentie -> knippen op andere plaats
• Isocaudomeren: herkennen ≠ sequentie -> produceren zelfde overhangende uiteindes
3. Plakken met Ligase
→ herstelt fosfodiësterbindingen in de DNA-ruggengraat
Reactiemechanisme
1. Zelf-adenylering
→ Ligase bindt op AMP groep in lysine residu in actieve centrum
2. Activatie
→ Adenylgroep overgedragen naar DNA 5’ P-uiteinde
3. Verzegeling
, BIOTECHNOLOGIE
→ 3’ OH-groep van andere streng valt 5’ P uiteinde aan en vormt covalente binding
→ AMP vrijgezet
Voorkomen van zelfligatie → fosfatasebehandeling !
= fosfaatgroepen op overhanguiteindes van vector hydrolyseren → geen zelfsluiting meer
mogelijk.
• BAP (=bacterial alkalin phosphatase)
• CIP (=calf intestinal mucosal alkalin phosphatase)
Opmerking: NIET bij gerichte klonering -> hebben geen compatibele uiteindes dus geen
zelfligatie
4. Transformatie
= verkregen recombinante construct in een levende gastheercel (meestal E. coli) brengen.
E. coli -> kan geen ‘naakt’ DNA opnemen -> COMPETENTE CELLEN maken!
Competente cellen maken
Chemische transformatie >< Fysische transformatie
CaCl2-hitteshock elektroporatie
* logfase!
1. ijskoude, hypotonische CaCl2-opl. 1. Sterk elektrisch veld
→ zwellen op (sferoplasten) → membraan polariseert + desoriëntatie
→ neutralisatie – lading van DNA mol. Lipide dubbellaag
en celmembraan → ontstaan van watergevulde poriën
→ Ca2+-DNA-complex → bescherming
DNasen voordeel: hogere transformatie efficiëntie
2. hitteshock (30-90s; 42°C)
→ ontstaan van poriën → DNA naar binnen
3. herstelfase
→ 1u – 37°C al schuddend
Doel:
1. Herstellen van beschadigde celmembraan en celwand
2. Aanrijking: cellen herstellen en prolifereren
3. Genexpressie
, BIOTECHNOLOGIE
5. Selectie
Genetisch materiaal succesvol opgenomen?
→ selectiemerkers: aanwezig op vector aanwezig (bv. antibioticaresistentie-genen)
Blauw-wit screening
α-COMPLEMENTATIE
1. Gastheercel: missen het α-deel van lacZ gen
2. Vector: met het lacZ α -fragment
Succesvol insert? lacZ α-gen verstoord = inactief enzym
MEDIUM
• Antibioticum: selectie van cellen die vector opgenomen hebben (met EN zonder insert)
• IPTG = inductor lac-operon
• X-GAL = chromogeen substraat → + β-galactosidase → hydrolyse blauw pigment
>> BLAUWE KOLONIES: geen insert (lege vector)
>> WITTE KOLONIES: insert aanwezig
H2 DNA opzuiveren
Hoofdvraag: Hoe krijgen we zuiver DNA/ RNA?
STAPPEN:
1. Cel lyseren
2. Onzuiverheden (bv. eiwitten) verwijderen
3. DNA concentreren
4. DNA analyseren/ bewaren
1. Lyseren
= openbreken van de cel zodat al het materiaal (incl. het DNA) vrijkomt
EDTA
• = chelerend agens (bevat metaalionen zoals Mg2+ en Ca2+)
• Doel:
>> beschermen tegen nuclease activiteit: Mg2 is een co-factor van endonucleasen
→ EDTA vangt deze → geen nuclease activiteit meer
>> verzwakken van celwand: Ca2+ neutraliseert – lading van het membraan
SDS = natriumdodecylsulfaat
• Anionisch
• Doel:
>> membraan oplossen: lipide-eiwit interacties verbreken
>> denaturatie van eiwitten: - lading zorgt voor ontvouwen van eiwit
