HEMATOPOËTISCHE STELSEL & ONDERZOEK
1. BLOED EN HEMATOPOËSE
1.A. Perifeer bloed
1.A.a. Rode bloedcellen (= RBC)
Erytrocyt = standaard RBC
- In de loop v rijping ➔ kern verliezen ➔ kernloze cel (geen DNA en RNA)
- = plat schijfje, soort discus
o In het midden = dunner ➔ opheldering
Normoblast = erythroblast
- In beenmerg ➔ RBC-voorlopers
- Normoblast is klaar om RBC vrij te geven aan perifeer bloed als:
o Kern uitgestoten uit normoblast ➔ enkel cytoplasma blijft over
o Wel nog RNA aanwezig ➔ basofiele kleur en reticulair patroon
o ➔ = reticulocyt
Reticulocyt = jonge RBC’en
- In beenmerg en perifeer bloed
- RNA ➔ meer basofiele kleur aan cytoplasma geven ➔ = reticulair patroon
o RNA gaat verloren als ouder wordt
Hemoglobine
- = zeer belangrijk element aanwezig in RBC
Hemoglobine A
- = tetrameer: 2 alfa-globine + 2 beta-globine
o Elke globine <2-3 elementen
- Als Hb in deoxy toestand (geen O2 gebonden)
o Één eenheid bestaat uit AZ keten met in
het midden een kern = heemkern
o Heemkern
▪ Bestaat uit 2 elementen
• Protoporfyrineketen
• 2 waardig ijzer ➔ Hb binden
o ➔ Elke eenheid:
▪ Globineketens
▪ Protoporfyrine
▪ 2 waardig ijzer
1
, - HbA = meest belangrijke Hb in erytrocyt van volwassene
o 2 andere vormen ook aanwezig:
▪ HbF
▪ HbA2
▪ ➔ bestaan uit 2 alfa-globineketens
Hemoglobine F
- = foetaal Hb
- = minder dan 1%
- Ipv beta- heb je gamma-ketens
Hemoblobine A2
- = ook maar klein percentage
- Ipv beta- heb je delta-ketens
!! Tekorten v bouwstenen ➔ microcytaire anemie ➔ slecht ontwikkeld cytoplasma van RBC ➔
kleinere RBC
1.A.b. Bloedplaatjes
➔ Primaire hemostase ➔ stollingscascade zet verder
- Veel granules erin ➔ basofiel granulair aspect
- Geen kern
1.A.c. Witte bloedcellen
= leukocyten
Versch celtypes behoren hiertoe
- RBC’en = allemaal hetzelfde type (afhankelijk van ouderdom welke naam)
Granulocyten
- Grote cellen
- Granules in cytoplasma = granulair aspect
o ➔ kleuren op andere manier ➔ verschillende granulocyten
➔ rol in aangeboren immuniteit (innate immunity)
- Leven zeer kort, enkele uren in perifeer bloed ➔ naar weefsel ➔ verdwijnt snel
Neutrofiel = belangrijkst, meest talrijk
2
, - Kleuren neutraal aan
- Meerlobbige kern
- ➔ Bacteriële en schimmelinfecties
Eosinofiel
- Korrels kleuren aan met eosine (roze kleurstof)
- 2-lobbige kern
- ➔ Bescherming tegen parasieten en worminfecties
Basofiel
- Kleurt aan met basofiele kleuring
o Zo intens aankleuren ➔ kern = onzichtbaar
- ➔ Actieve stoffen vrijzetten/loslaten, exacte rol = onduidelijk
Lymfocyten
- Leeft jarenlang ➔ drager v adaptieve immuniteit
- Heel dense kern met klein randje cytoplasma
T-lymfocyten
➔ Celgemedieerde immuniteit
B-lymfocyten
➔ Humorale immuniteit
NK-cellen
➔ Bescherming tegen virussen en kanker
Monocyten
- Leven redelijk kort
o Levensduur: lymfocyten > monocyten > granulocyten
- ➔ opruimdienst
1.B. Beenmerg
Plaats van hematopoëse verplaatst doorheen leven:
Fetale leven
- Eerst: in dooierzak
- Later: lever en milt
- Nog later: beenmerg
Postnatale leven
Vanaf 4-5 maand: uitsluitend in beenmerg
- Zuigeling:
o Moet nog veel groeien
o bloedvormend (“rood”) merg in volledige skelet
3
, ▪ ➔ er kan in tibia geprikt worden voor beenmergonderzoek
- Volwassene:
o In axiaal skelet en proximale tubulaire beenderen
o In pathologische condities (myelofibrose, botmetastasen, …) ➔ opnieuw
extramedullaire hematopoëse ontstaan in lever of milt ➔ hepato- of splenomegalie
Hematopoëse = zeer actief gebeuren met extreme regeneratieve capaciteit
Verloop erytropoëse in beenmerg:
Begint met pluripotente hematopoëtische stamcel (HSC)
- = zeldzame cel
- Bevindt zich in hematopoëtische niches
o Goed afgeschermd van toxines
- ➔ = in staat om asymetrisch te delen
o Enerzijds hematopoëtische stamcel genereren = “self-renewal” ➔ behoud van
stamcelpool
o Anderzijds cel maken die verder gaat differentiëren ➔ rijping van bloedcellen
- = Pluripotent: kan naar verschillende cel- en weefseltypes differentiëren
o Kan in versch cellen delen, je kan nog differntiëren naar andere weefseltypes
- Grotendeels slapende stamcelpool in afgeschermde “niches”
o Pool v cellen die metabool weinig actief is ➔ zorgt voor assymetrische celdeling
- CD34+, CD38-, negatief voor lineage-merkers
Pluripotente cellen worden multipotent progenitor
- Ze kunnen in verschillende hematologische celtypes differentiëren
- Delen heel veel
- In begin: enorm proliferatiepotentieel ➔ hoe verder differentieren ➔ minder
proliferatiecapaciteit ➔ op het einde kan zelfs volledig verliezen
Na tijd: voorlopers van specifieke cellen in herkennen
- Ook nog sterk delen
o Na tijd: verliezen van delingscapaciteit
- Uiteindelijk rijpe celtypes ➔ aan perifeer bloed vrijgeven
4
,Hoe verder differentiëren ➔ meer beslissingen nemen
Eerste beslissing: CMP (common myeloid precursor) of CLP (common lymphoid precursor)
- Lymfoïde progenitor ➔ lymfopoïese
o Pro-B
o Pro-T
o Pro-NK
- Myeloïde progenitor ➔ myelopoëse
o MEP (megakaryocyte/erythroocyte precursor)
▪ MkP (megakaryocytaire precursor)
▪ ErP (erytrocytaire precursor)
o GMP (granulocyte/monocyte precursor)
- Bloedplaatjes, RBC’en en granulocyten = post-mitotische cellen: ze kunnen niet meer delen
o (Ze hebben geen kern meer)
- Lymfoïde cellen kunnen wel nog delen
o Celdeling = essentieel voor clonale respons
o ➔ Gaan terug prolifereren ➔ immunologisch antwoord op te
bouwen
- Monocyten
o = vuilnisdienst
o Kunnen ook differentieren ➔ specifieke functies opnemen
o ➔ belangrijke rol in diverse organen
2. DIAGNOSTIEK VAN HEMATOLOGISCHE
AANDOENINGEN
2.A. Anamnese en klinisch onderzoek
Blijft belangrijk, kan op veel manieren mislopen!
Algemene functies
- RBC’en ➔ O2 transport
- WBC’en ➔ infectieuze weerstand
- Bloedplaatjes ➔ primaire hemostase
Te weinig RBC’en
- Minder harde huidskleur, bleke kleur v conjuctivae
- Minder O2 transportcapaciteit
o In rust sneller kortademig
o Hart gaat compenseren ➔ sneller kloppen
- Hart, spieren, hersneen hebbel veel O2 nodig ➔ dysfuncties op die niveaus
o Minder O2 in hart ➔ tachycard
▪ Coronaire ischemie en pijn bij inspanning
o Minder O2 in hersenen ➔ verward
Te weinig WBC’en
- Kwetsbaar voor infecties
o Respiratoir systeem = meest kwetsbaar ➔ longontstekingen + bronchitis vaak
- Opgezette klieren vaak ➔ slagen er niet in om infecties te klaren
Te weinig bloedplaatjes
- Vooral bloedingen
o Op huid zien, maar ook interne organen ➔ ernstige gevolgen
Te veel RBC’en
- Huid = roder
- Hyperviscositeit
5
, - Organomegalie evt ➔ lever en milt
Te veel WBC’en
- Verliezen normale WBC’en ➔ infecties nog ontwikkelen
- Hyperviscositeit
o Problemen op niveau v hart, longen, hersenen
o Botpijnen doordat cellen te snel groeien
Te veel Bloedplaatjes
- Hyperviscositeit
o Minder bevloeiing longen, hart, hersenen
2.B. Beeldvorming
Kort beeldvormingstechnieken overlopen:
- Echografie
- CT (computed tomography)
o Links en rechts vergelijken
o Massa zien links ➔ lymfeklierkanker
- MRI (magnetic resonance imaging)
- PET (positron emission tomography)
o FDG inspuiten ➔ opgenomen door cellen die glucose nodig hebben
▪ = hypermetabole cellen
- PET-CT (combinatie PET met CT)
o PET en CT tegelijk ➔ perfussiebeelden meteen te zien ➔ makkelijk om te zien waar
meest actief is
o ➔ bepalen welke klier nemen: uitgebreidheid, locatie
o + tijdens behandeling kijken hoe behandeling verloopt
2.C. Onderzoek van cellen en weefsels
2.C.a. Onderzoek van cellen in suspensie
Afname
- Bloed
o Ahv bloedname
▪ Venapunctie ➔ buisje ➔ tube ➔ naar labo
▪ Belang: van juiste tube met juiste recipiënt voor onderzoek
- Beenmerg
o Ahv beenmergaspiratie (door neg druk)
▪ Klassiek in crista iliace post. onder lokale anesthesie
▪ Naald doorheen cortex naar trabeculair bot
▪ Opzuigen en uitsmeren op draagglaasje ➔ cytologie
▪ Kan ook biopsie ➔ cilinder wegnemen ➔ hematopathologie
- Lumbaal vocht
- Urine
- Pleuravocht
- Gewichtsvocht
Telling
Coulterprincipe = cell teller + cell sizer
- Elke cel die passert wordt geteld
- Principe
o Analytisch deel met pipet en klein gaatje
▪ Binnenkant pipet met elektrode
▪ Buitenkant pipet met elektrode
o Toestel zuigt bloed aan naar binnenkant v pipet
6
, o Alle partikels passeren door nauwe gaatje
o Weerstand verandert telkens als iets passeert ➔ wordt geregistreerd
▪ Hoe groter weerstand, grotere cellen ➔ ook cel sizer
Moderne toestellen
- Nog altijd berusten op Coulterprincipe
- ➔ kunnen zelfs WBC’en differentiëren ➔ CBC = complete blood count
- Teller kan alarm geven ➔ je moet verder bekijken
Morfologisch onderzoek
vloeibaar: cytologie
- Bloed of beenmergaspiraat
- Door dr. of apr. klinisch bioloog
- Beoordeling van perifeer bloed of beenmergaspiraat:
o Cellulariteit (verhoogd, normaal, verlaagd)
o Welke celtypes (normaal of abnormaal) en in welke verhouding (normaal of
abnormaal)?
o Morfologisch aspect van de verschillende celtypes?
o Voor beenmerg ook: is het representatief
▪ Heb je een representatieve punctie
▪ Soms prik je ernaast ➔ meer bloed dan beenmerg aspireren
▪ 2 technieken om te kijken
1. Mergbrokjes aanwezig
o ➔ zeker dat beenmerg is
2. Kijken naar formule
o Enkel cellen v perifeer bloed terugvinden ➔ niet representatief
- Cytologie vraagt veel tijd ➔ ook geautomatiseerd al deels
o In UZL: straten vol machines
▪ Straat met celtellers ➔ ook differentiatie verschillende celtypes
▪ Als alarm ➔
• Vroeger: cytologisch onderzoek door laboranten
• Nu: toestellen die automatiseren
weefselbiopt: pathologisch onderzoek
- ➔ zie pathologie, hier niet besproken
Immunologisch onderzoek
- Bij lymfocyten: je ziet verschil niet tussen B- en T-lymfocyten ➔ immunologische technieken
hiervoor gebruiken
- Flow-cytometrie (vloeibare weefsels)
o Ahv kleurstoffen kijken welke merkers aan cel gebonden en welke merkers niet binden
o Kijken ahv flowcytometer
▪ = toestel met lazers
▪ Cellen passeren één voor één
▪ Lichtsignalen capteren
▪ ➔ celpopulaties heel gedetailleerd onderzoeken
- Microscopie (biopt: immunohistochemie, immunofluorescentie)
Genetisch onderzoek (wordt apart behandeld na hoofdstuk 5)
- Karyotype (alleen levende cellen/weefsels)
- FISH (vloeibare weefsels; biopt)
- Moleculaire testen (vloeibare weefsels; biopt)
2.C.b. Onderzoek van weefsels: beenmerg, lymfeklier, milt
➔ zie pathologie, hier niet besproken
7
,2.C.c. Genetische analyses bij (hematologische) maligniteiten
Waarom genetische analyses bij de patient met kanker ?
- Genetische mutaties in de kiemlijn: erfelijke ziekten
- Mutaties van vader of moeder erven ➔ alle lichaamscellen dragen mutatie ➔ syndromale
beelden
o Soms mono-orgaanziekten, maar wel alle cellen van organismen = aangetast
o Ook gonaden = aangetast ➔ volgende generatie: mutatie wordt doorgegeven
Bij kanker
- Genetisch materiaal van cellen bekijken: genetisch afwijkingen in lymfeklier = aanwezig
- Bij huidbiopt: geen afwijking in te vinden
- Genetische afwijking: alle afstammeling van kankercel geen mutatie dragen
o Als geen afstammeling van kankercloon ➔ niet de afwijking
- = ziekte verworven tijdens leven
- Kan ook verantwoordelijk zijn voor vroegtijdige veroudering in de weefsles
DNA-replicatie = proces met zeer weinig fouten
- = juist in grote lijnen
- DNA heeft 3miljard basenparen
- Kopiëren gebeurt nooit foutloos ➔ ongeveer 3 fouten per celdeling maken
o Kleine intrinsieke foutenlast in DNA van dochtercellen
- Als ongezond leven: nog sneller fouten oplopen
o Carcinogenen beschadigen basen in DNA
o Roken = belangrijkste carcinogeen ➔ versneld mutaties als roken
- DNA-herstelmechanismen ➔ fouten corrigeren
o Als hier fout ➔ mutator fenotype ➔ versnelde accumulatie van fouten in DNA
o Chemo-therapie: door introduceren van fouten in DNA ➔ cellen in apoptose duwen
▪ Maar kan ook voor fouten zorgen in normale niet-delende weefsels
- Hoe meer fouten oplopen, hoe groter de kans op kankerontwikkeling
o Niet elke fout = even erg
o Maar 1,5% an DNA codeert ➔ maakt niet uit als in niet-coderend gebied codeert
o Niet alle stukken worden gebruikt in alle cellen: soms mutatie in deel dat niet belangrijk
is voor die specifieke cel
▪ Als wel belangrijk ➔ driver-mutatie
• =Mutaties die biologisch gedrag van cel gaan veranderen
o Meer kritische drivermutaties ➔ evolutie van cel met normaal gedrag tot cel die meer
deelt tot cel die zich maligne gedraagt
- Soms zeer vroege ontwikkleing van kanker
o Te maken met tumorsupressor- gen dat al is uitegschakelt
o Te maken met DNA-repair mechanismen op ernstige basis beschadigd ➔ personen
gaan veel sneller mutaties opstapelen ➔ veel jongere leeftijd kanker ontwikkelen
Karyotype
- Eerste keer door hebben in jaren ‘60
o Philadelphia chromosoom = typisch bij CML (zie hoofdstuk 5)
▪ Deze afwijking = motor achter de ziekte, bepaalt waarom cel zich abberant
gedraagt
▪ Oorzaak in fusiegen dat door uitwisseling van genetisch materiaal ontstaat op
chromosoom 22 = BCR-ABL1-fusiegen
- Cytogenetisch onderzoek doen om aan te tonen ➔ karyotype
o Levende cellen in cultuur brengen/ doen groeien
o Specifieke medicatie: vincristine/ vinkaloïden ➔ metafase-arrest
▪ Alle cellen blijven in metafase gefixeerd
o Chromosomen “harvesten”/”oogsten” van maligne cellen
8
, ▪ Proberen vangen net voor de mitose/ net voor ze zich gaan delen
o Cellen op draagglassje: je krijgt een metafase-spreat
o Visualiseren onder microscoop
- Cellen moeten levend zijn om te oogsten
o Heparine-tube nodig = groene dop (want natuur = levend)
o Belang om geïnvadeerd weefsel, bloed, beenmerg aanbieden
▪ Als staal zonder ziekte ➔ je gaat niets vinden
▪ Myeloïde aandoeningen: beste staal = beenmerg
Fluorescence-in-situ-hybridisation = FISH
- Sequentie van gen moet gekend zijn
- Door denaturatie en renaturatie ➔ complementaire sequenties gaan binden
- Door probes te kiezen ➔ verschillende situaties opsporen
o Normaal: 2 identieke exemplaren van alle chromosomen met zelfde anatomie
o Afwijkingen:
▪ 2 probes van 2 plaatsen die dicht bij elkaar liggen + 2 probes verschillend
fluorochroom geven
▪ Als samenliggen ➔ co-lokalisatie
▪ Als gen gebroken ➔ genen liggen apart
▪ Als fusiegen terwijl uit elkaar liggen normaal ➔ co-lokalisatie/ fusie-signaal
▪ Genamplificatie ➔ intenser signaal dan verwacht
▪ Gen verliezen ➔ verlies van signaal
- Metafase-FISH: FISH op chromosomen van karyotype
o 2 groene signalen dicht bij elkaar (2 signalen door 2 zusterchromatiden) = normale 22
o 2 rode signalen diecht bij elkaar = normale 9
o Fusiesignaal op chromosoom 22: groen signaal en rood signaal op 22
o ➔ BCR-ABL-fusie aantonenn
- Ook FISH op interfase cellen: ook op niet-levende cellen diagnostiek mogelijk!
- Metafase FISH ➔ levende cellen nodig: heparine-tube
- Interfase FISH ➔ kan ook op EDTA-tube of parafine-materiaal
PCR
- Vooral op RNA-materiaal
o Omzetten op copy-DNA
o Vermenigvuldigen
- Cycly
o Verhoging T: denaturatie
o Verlaging T: annealing
o Verhoging T: polymeriseren
- Expansie van amplicon door 2 primers
- = zeer krachtige techniek
o Vertrekt vanuit kleine hoeveelheid DNA/RNA ➔ voldoende materiaal genereren ➔
analyseren
- Geen cellen met delingscapaciteit nodig
o Alle mogelijke stalen kunnen gebruikt worden
Next-generation-sequencing = NGS
9
, - Veel versch segmenten simultaan analyseren
o Massief paralel sequencen
- DNA fragmenteren in kleine stukjes
- Alle individuele stukjes op chip aanbrengen ➔ analyseren
- Kan pas als individuele stukjes = geamplifieerd
o Ahv DNA-replicatie
- Dan sequencen
o Sequentie bepalen door fluorescente nucleotiden aan te bieden
o Bv A = rood, T = blauw, …
- ➔ volgen door hoge resolutie camera
o Sequentie afleiden door kleuren van camera te volgen
- Code aflezen door opeenvolging van kleuren
o Door vergelijking met referentiegenoom: afwijking zoeken
Liquid biopsy of celvrij DNA uit plasma
- Belang van juiste materiaal biopsieren bij kanker
- Als cellen sterven/ in apoptose ➔ DNA komt vrij in extracell weefsels + bereikt voor deel het
plasma
o In plasma: celvrij DNA van cellen die in bloed circuleren of niet in bloed circuleren
▪ Normale cellen, maar ook kankercellen/ cellen van ZS (bv NIPT-test)
o In fractie celvrij DNA van serum: celvrij DNA van gezonde cellen + celvrij DNA afkomstig
van kankercellen (= circulerende tumor-DNA)
- Techniek = handig, want mekkelijker plasma/serum bekomen dan biopsie bekomen
Welke test gebruiken op zoek naar mutaties in kanker?
- Humaan genoom/kankergenoom
o Zeer uitgebreid genoom, maar er is maar klein deel coderend DNA
▪ ~ 3,2 x 109 bp
▪ 20000 - 25000 genen: exoom : 1,5 % van bp
▪ van ~ 95 % van de sequentie is de functie onbekend
- Welke test hebben we nodig ?
o Specifieke afwijking ➔ gericht onderzoek
o Onbepaalde afwijking ➔ genoomwijd
Als pt gediagnosticeerd met kanker
- Stel CML: beenmerg zit dominant vol met afwijkende
leukemische cellen
o Test nodig die niet zeer performant is
o Geen test nodig die 1 afwijkende cel op 10 000 normale
cellen moet terugvinden
o ➔ test gebruiken die niet zeer goede detectielimiet heeft
- Genezing of niet?
o Kanker is weg als geen cellen over
o Testen die klein aanta kankercellen kunnen detecteren = testen met zeer lage
detectiedrempel
- Detectiedrempel van testen kan verschillen afhankelijk van situatie
10
1. BLOED EN HEMATOPOËSE
1.A. Perifeer bloed
1.A.a. Rode bloedcellen (= RBC)
Erytrocyt = standaard RBC
- In de loop v rijping ➔ kern verliezen ➔ kernloze cel (geen DNA en RNA)
- = plat schijfje, soort discus
o In het midden = dunner ➔ opheldering
Normoblast = erythroblast
- In beenmerg ➔ RBC-voorlopers
- Normoblast is klaar om RBC vrij te geven aan perifeer bloed als:
o Kern uitgestoten uit normoblast ➔ enkel cytoplasma blijft over
o Wel nog RNA aanwezig ➔ basofiele kleur en reticulair patroon
o ➔ = reticulocyt
Reticulocyt = jonge RBC’en
- In beenmerg en perifeer bloed
- RNA ➔ meer basofiele kleur aan cytoplasma geven ➔ = reticulair patroon
o RNA gaat verloren als ouder wordt
Hemoglobine
- = zeer belangrijk element aanwezig in RBC
Hemoglobine A
- = tetrameer: 2 alfa-globine + 2 beta-globine
o Elke globine <2-3 elementen
- Als Hb in deoxy toestand (geen O2 gebonden)
o Één eenheid bestaat uit AZ keten met in
het midden een kern = heemkern
o Heemkern
▪ Bestaat uit 2 elementen
• Protoporfyrineketen
• 2 waardig ijzer ➔ Hb binden
o ➔ Elke eenheid:
▪ Globineketens
▪ Protoporfyrine
▪ 2 waardig ijzer
1
, - HbA = meest belangrijke Hb in erytrocyt van volwassene
o 2 andere vormen ook aanwezig:
▪ HbF
▪ HbA2
▪ ➔ bestaan uit 2 alfa-globineketens
Hemoglobine F
- = foetaal Hb
- = minder dan 1%
- Ipv beta- heb je gamma-ketens
Hemoblobine A2
- = ook maar klein percentage
- Ipv beta- heb je delta-ketens
!! Tekorten v bouwstenen ➔ microcytaire anemie ➔ slecht ontwikkeld cytoplasma van RBC ➔
kleinere RBC
1.A.b. Bloedplaatjes
➔ Primaire hemostase ➔ stollingscascade zet verder
- Veel granules erin ➔ basofiel granulair aspect
- Geen kern
1.A.c. Witte bloedcellen
= leukocyten
Versch celtypes behoren hiertoe
- RBC’en = allemaal hetzelfde type (afhankelijk van ouderdom welke naam)
Granulocyten
- Grote cellen
- Granules in cytoplasma = granulair aspect
o ➔ kleuren op andere manier ➔ verschillende granulocyten
➔ rol in aangeboren immuniteit (innate immunity)
- Leven zeer kort, enkele uren in perifeer bloed ➔ naar weefsel ➔ verdwijnt snel
Neutrofiel = belangrijkst, meest talrijk
2
, - Kleuren neutraal aan
- Meerlobbige kern
- ➔ Bacteriële en schimmelinfecties
Eosinofiel
- Korrels kleuren aan met eosine (roze kleurstof)
- 2-lobbige kern
- ➔ Bescherming tegen parasieten en worminfecties
Basofiel
- Kleurt aan met basofiele kleuring
o Zo intens aankleuren ➔ kern = onzichtbaar
- ➔ Actieve stoffen vrijzetten/loslaten, exacte rol = onduidelijk
Lymfocyten
- Leeft jarenlang ➔ drager v adaptieve immuniteit
- Heel dense kern met klein randje cytoplasma
T-lymfocyten
➔ Celgemedieerde immuniteit
B-lymfocyten
➔ Humorale immuniteit
NK-cellen
➔ Bescherming tegen virussen en kanker
Monocyten
- Leven redelijk kort
o Levensduur: lymfocyten > monocyten > granulocyten
- ➔ opruimdienst
1.B. Beenmerg
Plaats van hematopoëse verplaatst doorheen leven:
Fetale leven
- Eerst: in dooierzak
- Later: lever en milt
- Nog later: beenmerg
Postnatale leven
Vanaf 4-5 maand: uitsluitend in beenmerg
- Zuigeling:
o Moet nog veel groeien
o bloedvormend (“rood”) merg in volledige skelet
3
, ▪ ➔ er kan in tibia geprikt worden voor beenmergonderzoek
- Volwassene:
o In axiaal skelet en proximale tubulaire beenderen
o In pathologische condities (myelofibrose, botmetastasen, …) ➔ opnieuw
extramedullaire hematopoëse ontstaan in lever of milt ➔ hepato- of splenomegalie
Hematopoëse = zeer actief gebeuren met extreme regeneratieve capaciteit
Verloop erytropoëse in beenmerg:
Begint met pluripotente hematopoëtische stamcel (HSC)
- = zeldzame cel
- Bevindt zich in hematopoëtische niches
o Goed afgeschermd van toxines
- ➔ = in staat om asymetrisch te delen
o Enerzijds hematopoëtische stamcel genereren = “self-renewal” ➔ behoud van
stamcelpool
o Anderzijds cel maken die verder gaat differentiëren ➔ rijping van bloedcellen
- = Pluripotent: kan naar verschillende cel- en weefseltypes differentiëren
o Kan in versch cellen delen, je kan nog differntiëren naar andere weefseltypes
- Grotendeels slapende stamcelpool in afgeschermde “niches”
o Pool v cellen die metabool weinig actief is ➔ zorgt voor assymetrische celdeling
- CD34+, CD38-, negatief voor lineage-merkers
Pluripotente cellen worden multipotent progenitor
- Ze kunnen in verschillende hematologische celtypes differentiëren
- Delen heel veel
- In begin: enorm proliferatiepotentieel ➔ hoe verder differentieren ➔ minder
proliferatiecapaciteit ➔ op het einde kan zelfs volledig verliezen
Na tijd: voorlopers van specifieke cellen in herkennen
- Ook nog sterk delen
o Na tijd: verliezen van delingscapaciteit
- Uiteindelijk rijpe celtypes ➔ aan perifeer bloed vrijgeven
4
,Hoe verder differentiëren ➔ meer beslissingen nemen
Eerste beslissing: CMP (common myeloid precursor) of CLP (common lymphoid precursor)
- Lymfoïde progenitor ➔ lymfopoïese
o Pro-B
o Pro-T
o Pro-NK
- Myeloïde progenitor ➔ myelopoëse
o MEP (megakaryocyte/erythroocyte precursor)
▪ MkP (megakaryocytaire precursor)
▪ ErP (erytrocytaire precursor)
o GMP (granulocyte/monocyte precursor)
- Bloedplaatjes, RBC’en en granulocyten = post-mitotische cellen: ze kunnen niet meer delen
o (Ze hebben geen kern meer)
- Lymfoïde cellen kunnen wel nog delen
o Celdeling = essentieel voor clonale respons
o ➔ Gaan terug prolifereren ➔ immunologisch antwoord op te
bouwen
- Monocyten
o = vuilnisdienst
o Kunnen ook differentieren ➔ specifieke functies opnemen
o ➔ belangrijke rol in diverse organen
2. DIAGNOSTIEK VAN HEMATOLOGISCHE
AANDOENINGEN
2.A. Anamnese en klinisch onderzoek
Blijft belangrijk, kan op veel manieren mislopen!
Algemene functies
- RBC’en ➔ O2 transport
- WBC’en ➔ infectieuze weerstand
- Bloedplaatjes ➔ primaire hemostase
Te weinig RBC’en
- Minder harde huidskleur, bleke kleur v conjuctivae
- Minder O2 transportcapaciteit
o In rust sneller kortademig
o Hart gaat compenseren ➔ sneller kloppen
- Hart, spieren, hersneen hebbel veel O2 nodig ➔ dysfuncties op die niveaus
o Minder O2 in hart ➔ tachycard
▪ Coronaire ischemie en pijn bij inspanning
o Minder O2 in hersenen ➔ verward
Te weinig WBC’en
- Kwetsbaar voor infecties
o Respiratoir systeem = meest kwetsbaar ➔ longontstekingen + bronchitis vaak
- Opgezette klieren vaak ➔ slagen er niet in om infecties te klaren
Te weinig bloedplaatjes
- Vooral bloedingen
o Op huid zien, maar ook interne organen ➔ ernstige gevolgen
Te veel RBC’en
- Huid = roder
- Hyperviscositeit
5
, - Organomegalie evt ➔ lever en milt
Te veel WBC’en
- Verliezen normale WBC’en ➔ infecties nog ontwikkelen
- Hyperviscositeit
o Problemen op niveau v hart, longen, hersenen
o Botpijnen doordat cellen te snel groeien
Te veel Bloedplaatjes
- Hyperviscositeit
o Minder bevloeiing longen, hart, hersenen
2.B. Beeldvorming
Kort beeldvormingstechnieken overlopen:
- Echografie
- CT (computed tomography)
o Links en rechts vergelijken
o Massa zien links ➔ lymfeklierkanker
- MRI (magnetic resonance imaging)
- PET (positron emission tomography)
o FDG inspuiten ➔ opgenomen door cellen die glucose nodig hebben
▪ = hypermetabole cellen
- PET-CT (combinatie PET met CT)
o PET en CT tegelijk ➔ perfussiebeelden meteen te zien ➔ makkelijk om te zien waar
meest actief is
o ➔ bepalen welke klier nemen: uitgebreidheid, locatie
o + tijdens behandeling kijken hoe behandeling verloopt
2.C. Onderzoek van cellen en weefsels
2.C.a. Onderzoek van cellen in suspensie
Afname
- Bloed
o Ahv bloedname
▪ Venapunctie ➔ buisje ➔ tube ➔ naar labo
▪ Belang: van juiste tube met juiste recipiënt voor onderzoek
- Beenmerg
o Ahv beenmergaspiratie (door neg druk)
▪ Klassiek in crista iliace post. onder lokale anesthesie
▪ Naald doorheen cortex naar trabeculair bot
▪ Opzuigen en uitsmeren op draagglaasje ➔ cytologie
▪ Kan ook biopsie ➔ cilinder wegnemen ➔ hematopathologie
- Lumbaal vocht
- Urine
- Pleuravocht
- Gewichtsvocht
Telling
Coulterprincipe = cell teller + cell sizer
- Elke cel die passert wordt geteld
- Principe
o Analytisch deel met pipet en klein gaatje
▪ Binnenkant pipet met elektrode
▪ Buitenkant pipet met elektrode
o Toestel zuigt bloed aan naar binnenkant v pipet
6
, o Alle partikels passeren door nauwe gaatje
o Weerstand verandert telkens als iets passeert ➔ wordt geregistreerd
▪ Hoe groter weerstand, grotere cellen ➔ ook cel sizer
Moderne toestellen
- Nog altijd berusten op Coulterprincipe
- ➔ kunnen zelfs WBC’en differentiëren ➔ CBC = complete blood count
- Teller kan alarm geven ➔ je moet verder bekijken
Morfologisch onderzoek
vloeibaar: cytologie
- Bloed of beenmergaspiraat
- Door dr. of apr. klinisch bioloog
- Beoordeling van perifeer bloed of beenmergaspiraat:
o Cellulariteit (verhoogd, normaal, verlaagd)
o Welke celtypes (normaal of abnormaal) en in welke verhouding (normaal of
abnormaal)?
o Morfologisch aspect van de verschillende celtypes?
o Voor beenmerg ook: is het representatief
▪ Heb je een representatieve punctie
▪ Soms prik je ernaast ➔ meer bloed dan beenmerg aspireren
▪ 2 technieken om te kijken
1. Mergbrokjes aanwezig
o ➔ zeker dat beenmerg is
2. Kijken naar formule
o Enkel cellen v perifeer bloed terugvinden ➔ niet representatief
- Cytologie vraagt veel tijd ➔ ook geautomatiseerd al deels
o In UZL: straten vol machines
▪ Straat met celtellers ➔ ook differentiatie verschillende celtypes
▪ Als alarm ➔
• Vroeger: cytologisch onderzoek door laboranten
• Nu: toestellen die automatiseren
weefselbiopt: pathologisch onderzoek
- ➔ zie pathologie, hier niet besproken
Immunologisch onderzoek
- Bij lymfocyten: je ziet verschil niet tussen B- en T-lymfocyten ➔ immunologische technieken
hiervoor gebruiken
- Flow-cytometrie (vloeibare weefsels)
o Ahv kleurstoffen kijken welke merkers aan cel gebonden en welke merkers niet binden
o Kijken ahv flowcytometer
▪ = toestel met lazers
▪ Cellen passeren één voor één
▪ Lichtsignalen capteren
▪ ➔ celpopulaties heel gedetailleerd onderzoeken
- Microscopie (biopt: immunohistochemie, immunofluorescentie)
Genetisch onderzoek (wordt apart behandeld na hoofdstuk 5)
- Karyotype (alleen levende cellen/weefsels)
- FISH (vloeibare weefsels; biopt)
- Moleculaire testen (vloeibare weefsels; biopt)
2.C.b. Onderzoek van weefsels: beenmerg, lymfeklier, milt
➔ zie pathologie, hier niet besproken
7
,2.C.c. Genetische analyses bij (hematologische) maligniteiten
Waarom genetische analyses bij de patient met kanker ?
- Genetische mutaties in de kiemlijn: erfelijke ziekten
- Mutaties van vader of moeder erven ➔ alle lichaamscellen dragen mutatie ➔ syndromale
beelden
o Soms mono-orgaanziekten, maar wel alle cellen van organismen = aangetast
o Ook gonaden = aangetast ➔ volgende generatie: mutatie wordt doorgegeven
Bij kanker
- Genetisch materiaal van cellen bekijken: genetisch afwijkingen in lymfeklier = aanwezig
- Bij huidbiopt: geen afwijking in te vinden
- Genetische afwijking: alle afstammeling van kankercel geen mutatie dragen
o Als geen afstammeling van kankercloon ➔ niet de afwijking
- = ziekte verworven tijdens leven
- Kan ook verantwoordelijk zijn voor vroegtijdige veroudering in de weefsles
DNA-replicatie = proces met zeer weinig fouten
- = juist in grote lijnen
- DNA heeft 3miljard basenparen
- Kopiëren gebeurt nooit foutloos ➔ ongeveer 3 fouten per celdeling maken
o Kleine intrinsieke foutenlast in DNA van dochtercellen
- Als ongezond leven: nog sneller fouten oplopen
o Carcinogenen beschadigen basen in DNA
o Roken = belangrijkste carcinogeen ➔ versneld mutaties als roken
- DNA-herstelmechanismen ➔ fouten corrigeren
o Als hier fout ➔ mutator fenotype ➔ versnelde accumulatie van fouten in DNA
o Chemo-therapie: door introduceren van fouten in DNA ➔ cellen in apoptose duwen
▪ Maar kan ook voor fouten zorgen in normale niet-delende weefsels
- Hoe meer fouten oplopen, hoe groter de kans op kankerontwikkeling
o Niet elke fout = even erg
o Maar 1,5% an DNA codeert ➔ maakt niet uit als in niet-coderend gebied codeert
o Niet alle stukken worden gebruikt in alle cellen: soms mutatie in deel dat niet belangrijk
is voor die specifieke cel
▪ Als wel belangrijk ➔ driver-mutatie
• =Mutaties die biologisch gedrag van cel gaan veranderen
o Meer kritische drivermutaties ➔ evolutie van cel met normaal gedrag tot cel die meer
deelt tot cel die zich maligne gedraagt
- Soms zeer vroege ontwikkleing van kanker
o Te maken met tumorsupressor- gen dat al is uitegschakelt
o Te maken met DNA-repair mechanismen op ernstige basis beschadigd ➔ personen
gaan veel sneller mutaties opstapelen ➔ veel jongere leeftijd kanker ontwikkelen
Karyotype
- Eerste keer door hebben in jaren ‘60
o Philadelphia chromosoom = typisch bij CML (zie hoofdstuk 5)
▪ Deze afwijking = motor achter de ziekte, bepaalt waarom cel zich abberant
gedraagt
▪ Oorzaak in fusiegen dat door uitwisseling van genetisch materiaal ontstaat op
chromosoom 22 = BCR-ABL1-fusiegen
- Cytogenetisch onderzoek doen om aan te tonen ➔ karyotype
o Levende cellen in cultuur brengen/ doen groeien
o Specifieke medicatie: vincristine/ vinkaloïden ➔ metafase-arrest
▪ Alle cellen blijven in metafase gefixeerd
o Chromosomen “harvesten”/”oogsten” van maligne cellen
8
, ▪ Proberen vangen net voor de mitose/ net voor ze zich gaan delen
o Cellen op draagglassje: je krijgt een metafase-spreat
o Visualiseren onder microscoop
- Cellen moeten levend zijn om te oogsten
o Heparine-tube nodig = groene dop (want natuur = levend)
o Belang om geïnvadeerd weefsel, bloed, beenmerg aanbieden
▪ Als staal zonder ziekte ➔ je gaat niets vinden
▪ Myeloïde aandoeningen: beste staal = beenmerg
Fluorescence-in-situ-hybridisation = FISH
- Sequentie van gen moet gekend zijn
- Door denaturatie en renaturatie ➔ complementaire sequenties gaan binden
- Door probes te kiezen ➔ verschillende situaties opsporen
o Normaal: 2 identieke exemplaren van alle chromosomen met zelfde anatomie
o Afwijkingen:
▪ 2 probes van 2 plaatsen die dicht bij elkaar liggen + 2 probes verschillend
fluorochroom geven
▪ Als samenliggen ➔ co-lokalisatie
▪ Als gen gebroken ➔ genen liggen apart
▪ Als fusiegen terwijl uit elkaar liggen normaal ➔ co-lokalisatie/ fusie-signaal
▪ Genamplificatie ➔ intenser signaal dan verwacht
▪ Gen verliezen ➔ verlies van signaal
- Metafase-FISH: FISH op chromosomen van karyotype
o 2 groene signalen dicht bij elkaar (2 signalen door 2 zusterchromatiden) = normale 22
o 2 rode signalen diecht bij elkaar = normale 9
o Fusiesignaal op chromosoom 22: groen signaal en rood signaal op 22
o ➔ BCR-ABL-fusie aantonenn
- Ook FISH op interfase cellen: ook op niet-levende cellen diagnostiek mogelijk!
- Metafase FISH ➔ levende cellen nodig: heparine-tube
- Interfase FISH ➔ kan ook op EDTA-tube of parafine-materiaal
PCR
- Vooral op RNA-materiaal
o Omzetten op copy-DNA
o Vermenigvuldigen
- Cycly
o Verhoging T: denaturatie
o Verlaging T: annealing
o Verhoging T: polymeriseren
- Expansie van amplicon door 2 primers
- = zeer krachtige techniek
o Vertrekt vanuit kleine hoeveelheid DNA/RNA ➔ voldoende materiaal genereren ➔
analyseren
- Geen cellen met delingscapaciteit nodig
o Alle mogelijke stalen kunnen gebruikt worden
Next-generation-sequencing = NGS
9
, - Veel versch segmenten simultaan analyseren
o Massief paralel sequencen
- DNA fragmenteren in kleine stukjes
- Alle individuele stukjes op chip aanbrengen ➔ analyseren
- Kan pas als individuele stukjes = geamplifieerd
o Ahv DNA-replicatie
- Dan sequencen
o Sequentie bepalen door fluorescente nucleotiden aan te bieden
o Bv A = rood, T = blauw, …
- ➔ volgen door hoge resolutie camera
o Sequentie afleiden door kleuren van camera te volgen
- Code aflezen door opeenvolging van kleuren
o Door vergelijking met referentiegenoom: afwijking zoeken
Liquid biopsy of celvrij DNA uit plasma
- Belang van juiste materiaal biopsieren bij kanker
- Als cellen sterven/ in apoptose ➔ DNA komt vrij in extracell weefsels + bereikt voor deel het
plasma
o In plasma: celvrij DNA van cellen die in bloed circuleren of niet in bloed circuleren
▪ Normale cellen, maar ook kankercellen/ cellen van ZS (bv NIPT-test)
o In fractie celvrij DNA van serum: celvrij DNA van gezonde cellen + celvrij DNA afkomstig
van kankercellen (= circulerende tumor-DNA)
- Techniek = handig, want mekkelijker plasma/serum bekomen dan biopsie bekomen
Welke test gebruiken op zoek naar mutaties in kanker?
- Humaan genoom/kankergenoom
o Zeer uitgebreid genoom, maar er is maar klein deel coderend DNA
▪ ~ 3,2 x 109 bp
▪ 20000 - 25000 genen: exoom : 1,5 % van bp
▪ van ~ 95 % van de sequentie is de functie onbekend
- Welke test hebben we nodig ?
o Specifieke afwijking ➔ gericht onderzoek
o Onbepaalde afwijking ➔ genoomwijd
Als pt gediagnosticeerd met kanker
- Stel CML: beenmerg zit dominant vol met afwijkende
leukemische cellen
o Test nodig die niet zeer performant is
o Geen test nodig die 1 afwijkende cel op 10 000 normale
cellen moet terugvinden
o ➔ test gebruiken die niet zeer goede detectielimiet heeft
- Genezing of niet?
o Kanker is weg als geen cellen over
o Testen die klein aanta kankercellen kunnen detecteren = testen met zeer lage
detectiedrempel
- Detectiedrempel van testen kan verschillen afhankelijk van situatie
10
