GeneticaGenomica
H6: recombinant DNA-technologie en genoomanalyse
1. Genomics
Genomics = de wetenschappelijke discipline die zich bezighoudt met het verkrijgen en analyseren van de
sequentie van complete genomen
Is een direct resultaat van het Human Genome Project
Functionele genomics: Gericht op het begrijpen hoe en wanneer elk gen in het genoom wordt gebruikt (de
functie van genen)
Vergelijkende genomics (Comparative genomics): Richt zich op het vergelijken van complete genomen om
inzicht te krijgen in evolutie en de fundamentele biologische verschillen tussen soorten.
Om genomen te bestuderen, zijn er twee cruciale stappen:
• DNA-fragmenten klonen
• DNA sequencen (de volgorde van nucleotiden bepalen)
Hybridisatie: het complementair binden van nucleïnezuurstrengen (DNA of RNA).
• DNA-DNA hybridisatie = twee complementaire DNA-strengen binden aan elkaar.
• DNA-RNA hybridisatie = een RNA-streng bindt aan een complementaire DNA-streng.
• RNA-RNA hybridisatie = twee complementaire RNA-strengen binden
2. Restrictie enzymen
= het gebruik van restrictie-enzymen (ook wel restrictie-endonucleasen genoemd) is essentieel voor het
kloneren en sequencen van DNA
Functie = het knippen van een gen bij een bepaalde, specifieke sequentie
Hoe werken ze?:
• Enzymen herkennen een specifieke herkenningssequentie op de DNA-streng
• Ze knippen het DNA op deze specifieke plek → ontstaan DNA-fragmenten
• 2 soorten fragmenten
- Sticky ends/cohesive ends = enkelstrenige stukjes handig voor plakken op ander DNA
- Blunt ends = streng is doormidden genkipt → niet nuttog
Afkomst:
• Geïsoleerd uit micro-organismen
• → vernoemd naar die organismen (meestal bacteriën)
1
,In biomedische Toepassingen: stuk van gen wordt in DNA van een ander organismen geplakt
• Ontstaan van recombinant DNA → in een recombinant organisme
Voorbeelden:
• Recombinant DNA-technologie = gebruikt om grote hoeveelheden medisch belangrijke eiwitten
(medicijnen) te produceren, zoals insuline
• Gen-therapie: dierlijke virussen, zoals retrovirussen, kunnen nuttige vectoren zijn voor gentherapie om
enkelvoudige genaandoeningen te behandelen.
• Diagnose:
- Recombinant DNA-probes = gebruikt om mutante genen op te sporen die verantwoordelijk zijn voor
erfelijke ziekten
- DNA-technologie = ingezet om virale of bacteriële infecties te detecteren (bv. PCR-testen).
Restrictiekaart maken:
= een schematische voorstelling van de locaties waar restrictie-enzymen DNA knippen
➔ laat zien hoe vaak en waar specifieke enzymen een DNA-molecuul knippen
➔ vaak gebruikt bij plasmiden, bacteriële chromosomen of virale DNA-moleculen om de structuur van DNA
in kaart te brengen
1) DNA isoleren
• Je begint met zuiver DNA (bijv. plasmide, bacterieel chromosoom)
2) DNA knippen met restrictie-enzymen
• Eén of meerdere restrictie-enzymen → knippen elk specifieke herkenningssequenties in het DNA
3) Gelelektroforese
• fragmenten worden gescheiden op agarosegel op basis van grootte → lengte meten (in bp)
4) Analyse van fragmentgroottes
• Fragmentgroottes vergelijken bij verschillende enzymen → positie van de knipplaatsen berekenen
• Bij combinaties van enzymen = kun je bepalen hoe de knipplaatsen ten opzichte van elkaar liggen
5) Tekenen van de restrictiekaart
• Gebruik de informatie van enkelvoudige en dubbele digests.
• Plaats de knippunten op een schematische DNA-lijn of cirkel (voor plasmiden).
• Voeg fragmentgroottes toe om de kaart volledig te maken
3. Genklonering en vectoren
= gebruikt bij DNA clonering
Gene cloning = het inbrengen van genetisch materiaal in een vector om specifieke genen te isoleren
2
, Vector = een DNA-molecule die kan worden gebruikt om gensequenties te vermenigvuldigen
• Kloneervector = kloneren een specifiek stuk DNA
• Faagvector = genetisch gemodificeerde bacteriofaag die dient als drager
voor vreemd DNA (insert).
- Kan DNA in bacteriën injecteren + kan zich in de gastheer
vermenigvuldigen
• Expressievector = zorgen dat een specifiek stuk DNA tot uiting komt
Eigenschappen van nuttige vectoren:
• Vector-DNA kan in een gastheercel (host cell) geïntroduceerd worden
• De vector bevat een replicatie-oorsprong zodat deze kan repliceren in een gastheercel
• Gastheercellen die de vector bevatten, kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd dankzij de
aanwezigheid van een antibioticaresistentiegen of een andere selecteerbare merker
• Eén of meer unieke restrictie-enzym-knipplaatsen (restriction enzyme cleavage sites)
3.1. Bibliotheken
Genomische bibliotheek = kijken als een gen aanwezig is
cDNA bibliotheek = kijken of een gen tot expressie komt
Genomische bib:
• = Alle genen (inclusief introns)
- Niet‐coderend DNA
- Regulatoire sequenties (promoters, enhancers…)
- Herhalingen, satelliet-DNA, intergene regio’s
• Hoe maken?:
- Genomisch DNA isoleren uit cellen, knippen met restrictie-enzym / Partiële digestie
- Inbouwen in een vector (vaak bacteriofage λ, BACs of plasmiden)
- Transformatie van bacteriën → elke bacteriekloon bevat één DNA-fragment
Samen vormen al die bacteriekoloniën of faagklonen de genomische bibliotheek
• Functie?:
- Identificatie van genen inclusief hun regulatie
- Sequencing van hele genomen
- Functionele studies van promotors en enhancers
- Opsporing van mutaties
3
H6: recombinant DNA-technologie en genoomanalyse
1. Genomics
Genomics = de wetenschappelijke discipline die zich bezighoudt met het verkrijgen en analyseren van de
sequentie van complete genomen
Is een direct resultaat van het Human Genome Project
Functionele genomics: Gericht op het begrijpen hoe en wanneer elk gen in het genoom wordt gebruikt (de
functie van genen)
Vergelijkende genomics (Comparative genomics): Richt zich op het vergelijken van complete genomen om
inzicht te krijgen in evolutie en de fundamentele biologische verschillen tussen soorten.
Om genomen te bestuderen, zijn er twee cruciale stappen:
• DNA-fragmenten klonen
• DNA sequencen (de volgorde van nucleotiden bepalen)
Hybridisatie: het complementair binden van nucleïnezuurstrengen (DNA of RNA).
• DNA-DNA hybridisatie = twee complementaire DNA-strengen binden aan elkaar.
• DNA-RNA hybridisatie = een RNA-streng bindt aan een complementaire DNA-streng.
• RNA-RNA hybridisatie = twee complementaire RNA-strengen binden
2. Restrictie enzymen
= het gebruik van restrictie-enzymen (ook wel restrictie-endonucleasen genoemd) is essentieel voor het
kloneren en sequencen van DNA
Functie = het knippen van een gen bij een bepaalde, specifieke sequentie
Hoe werken ze?:
• Enzymen herkennen een specifieke herkenningssequentie op de DNA-streng
• Ze knippen het DNA op deze specifieke plek → ontstaan DNA-fragmenten
• 2 soorten fragmenten
- Sticky ends/cohesive ends = enkelstrenige stukjes handig voor plakken op ander DNA
- Blunt ends = streng is doormidden genkipt → niet nuttog
Afkomst:
• Geïsoleerd uit micro-organismen
• → vernoemd naar die organismen (meestal bacteriën)
1
,In biomedische Toepassingen: stuk van gen wordt in DNA van een ander organismen geplakt
• Ontstaan van recombinant DNA → in een recombinant organisme
Voorbeelden:
• Recombinant DNA-technologie = gebruikt om grote hoeveelheden medisch belangrijke eiwitten
(medicijnen) te produceren, zoals insuline
• Gen-therapie: dierlijke virussen, zoals retrovirussen, kunnen nuttige vectoren zijn voor gentherapie om
enkelvoudige genaandoeningen te behandelen.
• Diagnose:
- Recombinant DNA-probes = gebruikt om mutante genen op te sporen die verantwoordelijk zijn voor
erfelijke ziekten
- DNA-technologie = ingezet om virale of bacteriële infecties te detecteren (bv. PCR-testen).
Restrictiekaart maken:
= een schematische voorstelling van de locaties waar restrictie-enzymen DNA knippen
➔ laat zien hoe vaak en waar specifieke enzymen een DNA-molecuul knippen
➔ vaak gebruikt bij plasmiden, bacteriële chromosomen of virale DNA-moleculen om de structuur van DNA
in kaart te brengen
1) DNA isoleren
• Je begint met zuiver DNA (bijv. plasmide, bacterieel chromosoom)
2) DNA knippen met restrictie-enzymen
• Eén of meerdere restrictie-enzymen → knippen elk specifieke herkenningssequenties in het DNA
3) Gelelektroforese
• fragmenten worden gescheiden op agarosegel op basis van grootte → lengte meten (in bp)
4) Analyse van fragmentgroottes
• Fragmentgroottes vergelijken bij verschillende enzymen → positie van de knipplaatsen berekenen
• Bij combinaties van enzymen = kun je bepalen hoe de knipplaatsen ten opzichte van elkaar liggen
5) Tekenen van de restrictiekaart
• Gebruik de informatie van enkelvoudige en dubbele digests.
• Plaats de knippunten op een schematische DNA-lijn of cirkel (voor plasmiden).
• Voeg fragmentgroottes toe om de kaart volledig te maken
3. Genklonering en vectoren
= gebruikt bij DNA clonering
Gene cloning = het inbrengen van genetisch materiaal in een vector om specifieke genen te isoleren
2
, Vector = een DNA-molecule die kan worden gebruikt om gensequenties te vermenigvuldigen
• Kloneervector = kloneren een specifiek stuk DNA
• Faagvector = genetisch gemodificeerde bacteriofaag die dient als drager
voor vreemd DNA (insert).
- Kan DNA in bacteriën injecteren + kan zich in de gastheer
vermenigvuldigen
• Expressievector = zorgen dat een specifiek stuk DNA tot uiting komt
Eigenschappen van nuttige vectoren:
• Vector-DNA kan in een gastheercel (host cell) geïntroduceerd worden
• De vector bevat een replicatie-oorsprong zodat deze kan repliceren in een gastheercel
• Gastheercellen die de vector bevatten, kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd dankzij de
aanwezigheid van een antibioticaresistentiegen of een andere selecteerbare merker
• Eén of meer unieke restrictie-enzym-knipplaatsen (restriction enzyme cleavage sites)
3.1. Bibliotheken
Genomische bibliotheek = kijken als een gen aanwezig is
cDNA bibliotheek = kijken of een gen tot expressie komt
Genomische bib:
• = Alle genen (inclusief introns)
- Niet‐coderend DNA
- Regulatoire sequenties (promoters, enhancers…)
- Herhalingen, satelliet-DNA, intergene regio’s
• Hoe maken?:
- Genomisch DNA isoleren uit cellen, knippen met restrictie-enzym / Partiële digestie
- Inbouwen in een vector (vaak bacteriofage λ, BACs of plasmiden)
- Transformatie van bacteriën → elke bacteriekloon bevat één DNA-fragment
Samen vormen al die bacteriekoloniën of faagklonen de genomische bibliotheek
• Functie?:
- Identificatie van genen inclusief hun regulatie
- Sequencing van hele genomen
- Functionele studies van promotors en enhancers
- Opsporing van mutaties
3
