Celbiologie II: regulatiemechanismen
Methoden in het celbiologisch onderzoek
Isolatie van celorganellen
Centrifugeren om celorganellen te onderscheiden → afhankelijk van kracht rotatie verschillende
organellen in supernatant + pellet: niet altijd met zuivere fractie dus verdere opsplitsing:
- Type 1 = densiteitsgradiënt centrifugatie: in buis stof met toenemende concentratie (bv
sucrose) + preparaat bovenop
o Zwaardere organellen sedimenteren sneller + zitten verder in buis
→ Aftappen (van onder naar boven): zwaardere in eerste buizen, lichtere in laatste
→ Erna testen erop doen bv op enzymatische activiteit
- Type 2 = equilibrium densiteitscentrifugatie: opnieuw met gradiënt + preparaat erboven →
lang centrifugeren (overnacht)
o Densiteit komt overeen met densiteit organel
→ Weer erop testen bv western blot
Microscopie
Zichtbaar licht wordt geconcentreerd op preparaat + beeld opvangen met lens
- Voorbereiden weefsel voor microscopie:
Biologisch materiaal fixeren:
o Denaturerende stoffen (bv formaldehyde)
o Voor EM (= elektronenmicroscopie): materiaal harder zijn → sterkere fixerende
stoffen (bv glutaraldehyde)
o Immersiefixatie of perfusiefixatie:
▪ Immersiefixatie: bv biopsie van tumor in fixatief gebracht
▪ Perfusiefixatie: via bloedsomloop fixatief inbrengen (bij proefdieren)
→ Maakt weefsel harder maar nog niet hard genoeg (dus inbedden = weefsel
omgeven met iets anders)
Inbedden:
o In paraffine
o In harsen voor EM
o Invriezen van weefsel: snellere + duurdere mogelijkheid
Snijden van coupes met:
o Microtoom
o Ultramicrotoom (100 nm)
o Vriesmicrotoom
- Aantonen van eiwitten, lipiden, suikers
Kleuringen:
o Histochemisch (bv H&E kleuring)
o Enzymatisch
o Immunocytochemie: te maken met cellen (in cultuur)
o Immunohistochemisch (gelijkaardig met western blot ELISA): te maken met coupes
▪ Enzymatische reactie met vorming van kleurstof
▪ Fluorescentie
• Fluorescentiemicroscopie: van zichtbaar licht 1 bepaalde golflengte
geselecteerd + valt in op preparaat + licht met lagere E en hogere
golflengte afgescheiden
• Confocale microscopie: licht van onder/boven preparaat naar
detector gestuurd = onscherp beeld, dus enkel licht dat
teruggekaatst wordt + door opening kan gedetecteerd = scherper
o Andere toepassingen van fluorescentiemicroscopie: visualisatie van levende cellen
in cultuur met fluorescente probes
▪ Geen fixatie preparaat
1
, ▪ Fluorescente merker (stoffen die enkel door bepaalde celorganellen
opgenomen)
• Toegediend aan medium + door cellen opgenomen
• In cellen tot expressie gebracht
▪ Fluorescentie microscopie: camera in microscoop + kijken in tijd waar
organel zit
o Immunogold: gebruikt voor EM: aan secundaire antistoffen goudpartikel
hechten + lichten op in EM
- Aantonen van RNA
o In situ hybridisatie
- Aantonen van DNA
o FISH = fluorescent in situ hybridisation
Celweek
- Bacteriën: cellen schudden tijdens kweek voor zuurstof
- Gisten: cellen schudden tijdens kweek voor zuurstof
- Zoogdiercellen:
1) Primaire culturen:
o Uit proefdier (bv levercellen, huidcellen, hersencellen, … isoleren)
o Uit mens (bv huidcellen, endotheelcellen, … isoleren)
→ Cellen losmaken van ECM = juncties breken: enzymes nodig (bv collagenase of EDTA:
bindt calcium (calcium essentieel voor cadherinesjuncties + desmosomen))
→ Gaan niet delen + beperkt houdbaar + specifieke karakteristieken verliezen
2) Cellijnen:
o Door immortaliseren van een primaire cultuur: in geïsoleerde
primaire cellen oncogen inbrengen door transfectie → cellen
blijven delen
o Uitgaande van tumor: tumorcel isoleren + blijven delen bv Hela
cellen (baarmoederhalskanker)
→ Blijven delen + kunnen invriezen
→ Naast glucose, AZ, lipiden, ook groeifactoren nodig om zoogdiercellen te
kweken + eigenschappen te bewaren
→ Groeifactoren duur + toegediend onder vorm van serum (= bloed waarvan
bloedcellen verwijderd zijn + veel groeifactoren nog inzitten bv uit (foetaal)
kalf)
→ Medium = buffermengsel: kleur indicatie (zuur) pH (+ moet vervangen worden) (wordt
zuur doordat cellen CO2 produceren)
→ Zoogdiercellen in laminaire flowcast om contaminatie tegen te gaan: constante flow +
ruimte onder flow = steriel
H1: sorteren van eiwitten
Eiwitten hebben ‘label’/adres of “targeting sequence” in primaire sequentie (voor- of achteraan)
Eiwit geen label → “default”: eiwit komt in cytosol terecht
Synthese van translatie eiwitten op ribosomen: 2 grote wegen
1) Eerste weg: mitochondriën, peroxisomen en nucleus (kern)
2) Secretorische weg: voornamelijk stoffen die afgescheiden worden door cel
Mitochondriën
- 2 membranen
- 4 compartimenten:
1) Buitenste membraan
2) Intermembranaire ruimte
3) Binnenste membraan
4) Matrix
2
,Eiwitten meestal enzymen in matrix → niet zomaar door membraan zonder E:
Import van matrixeiwitten:
- Signaal aan positieve N-terminus:
o Van 20 – 50 AZ lang:
▪ Hydrofobe AZ
▪ Positief geladen basische AZ
▪ Gehydroxyleerde AZ
- Eiwitten niet gevouwen, maar na synthetisatie neiging om te vouwen in waterig
omgeving van cytosol → andere eiwitten bij te pas => chaperones (Hsp70)
- Tom (= Translocator outer mitochondrial membrane)
- Tim (= Translocator inner mitochondrial membrane)
- Import:
Eiwit ontvouwen door binding aan chaperone + gaat door kanaaltje van buitenste
membraan gevormd door Tom eiwitten → doorheen binnenste membraan met
kanaaltje gevormd door Tim eiwitten + in matrix: signaalsequentie (positieve N-terminus)
afgesplitst door protease en eiwit kan vouwen
o Mogelijk als kanaaltje Tom in verlengde ligt van kanaaltje Tim (kan niet op
om even welke plaats (1000tal plaatsen waar deze contacten aanwezig zijn)
o Vergt E voor:
▪ Binding chaperone om eiwit in ontvouwen toestand te houden
▪ Motoreiwit dat eiwit door binnenste mitochondriale membraan
trekt: chemische ATP → mechanische E om binnenkomende
eiwitstreng vastnemen + eiwit naar binnen
▪ Potentiaalverschil over binnenste membraan: kost E om
spanningsverschil op te bouwen
• Buitenkant positief
• Binnenkant negatief
→ helpt om positieve eiwit naar binnen te trekken
- Membraaneiwitten:
1) Eiwit opzijgeschoven (deels in matrix, deels in intermembranaire ruimte)
a. Doorheen buitenste + deels doorheen binnenste membraan
b. Volledig door binnenste (signaalsequentie afgesplits) + terug
naar kanaal en opzijgeschoven
2) Volledig in intermembranaire ruimte (tussen 2 membranen):
a. Doorheen buitenste
b. Doorheen buitenste + binnenste (signaalsequentie afgesplitst) en dan terug
door kanaal in intermembranaire ruimte
- Voorbeeld belang mitochondriaal import:
Vorm nierkanker → mutatie enzym dat DNA-sequenties herstelt = problemen in
signaalsequentie
2 signalen:
1) NLS (= Nucleair localisatie signaal)
2) MTS (= Mitochrondiaal targeting signaal): vooraan eiwitsequentie + door
alternatieve splicing al dan niet aanwezig
→ Eiwit ofwel in mitochondriën of kern terechtkomen, maar bij defect targeting sequence:
andere AZ bv G vervangen door E → negatieve lading stoort positieve eigenschap eiwit: komt
niet in mitochondriën terecht => aanleiding mitochondriaal DNA niet beschermt + bijdrage
ontstaan nierkanker
3
, Peroxisomen
- Organellen omgeven door enkelvoudige membraan
- Aanwezig in (alle) eukaryote cellen: niet in rode bloedcellen
- Variëren in vorm, grootte, aantal naargelang celtype
- “microbodies”
- Matrixeiwitten → weer 2 signaalsequenties mogelijk:
1) PTS2: N-terminus
2) PTS1 (= Peroxisoom targeting signaal 1):
▪ C-terminus (uiteinde eiwit)
▪ 3 AZ (voldoende om eiwit naar peroxisomen te brengen)
▪ Consensus = SKL (Serine, Lysine, Leucine): meest
voorkomend signaal (≠ altijd zelfde signaal: wel
AZ met altijd zelfde eigenschappen bv lysine
niet vervangen door zuur/hydrofoob AZ)
- Import van PTS1 eiwitten:
Pex5-receptor herkent PTS1-sequentie aan carboxyl-uiteinde in cytosol + pex5 affiniteit
voor pex14-membraaneiwit en bindt
o Hoe eiwit in membraan? = nog niet zeker: pex14 maakt tijdelijk kanaaltje?
o Mutatie (in pex14, 10 of 5) → ernstige ziekten: sterven binnen 1ste levensjaar
Kern
- Import en export
- Dubbele membraan
- Grote poriën = Nuclear pore complex
o Onderbreekt dubbele mebraan
o Nuclear basket:
▪ Complex met 100 eiwitten gericht naar
• Cytoplasma: eiwitten naar porie brengen
• Nucleus/kern (structuur lijkt op basket)
o Kleine moleculen/ionen via poriën vrij verplaatsen:
diffunderen (passieve diffusie)
o Grote (eiwitten) kost E
- Import (van cytosol naar kern):
Eerst eiwitten tot transcriptie in kern + dan naar cytosol om tot translatie komen + terug in kern:
eiwit met nucleair localisatiesignaal bindt aan eiwit importine + contact met ‘eiwitdraadjes’ op
nuclear basket → doorheen kanaaltje: eiwit-importinecomplex grote affiniteit => eiwit
Ran/GTP bindt met importine + eiwit komt los in kern + Ran/GTP – importine
getransporteerd naar cytosol en GTP zet fosfaat af = Ran/GDP + importine komt vrij in
cytosol → Ran/GDP terug naar kern + terug gerecycleerd tot Ran/GTP
o Bv bij: Transcriptiefactoren, polymerasen, …
o Ran = small GTP binding protein (wisselt tussen GTP/GDP gebonden vorm)
o Nucleair localisatiesignaal:
▪ Positieve AZ (Bv Lys, Arg)
▪ Niet aan N- of C-terminus maar binnenin met eventueel “onderbrekingen”
▪ “Onderbrekingen”: localisatiesignaal AZ verspreid MAAR stukjes
noodzakelijk + voldoende anders geen signaal
- Export (van kern naar cytosol):
Eiwit met NES bindt aan eiwit exportine en aan Ran/GTP + via nuclear basket naar cytoplasma
→ Ran/GTP gesplitst + E komt vrij en eiwit komt los van complex + exportine en Ran/GDP
terug gerecycleerd naar kern
o NES = Nuclear export signal
4
Methoden in het celbiologisch onderzoek
Isolatie van celorganellen
Centrifugeren om celorganellen te onderscheiden → afhankelijk van kracht rotatie verschillende
organellen in supernatant + pellet: niet altijd met zuivere fractie dus verdere opsplitsing:
- Type 1 = densiteitsgradiënt centrifugatie: in buis stof met toenemende concentratie (bv
sucrose) + preparaat bovenop
o Zwaardere organellen sedimenteren sneller + zitten verder in buis
→ Aftappen (van onder naar boven): zwaardere in eerste buizen, lichtere in laatste
→ Erna testen erop doen bv op enzymatische activiteit
- Type 2 = equilibrium densiteitscentrifugatie: opnieuw met gradiënt + preparaat erboven →
lang centrifugeren (overnacht)
o Densiteit komt overeen met densiteit organel
→ Weer erop testen bv western blot
Microscopie
Zichtbaar licht wordt geconcentreerd op preparaat + beeld opvangen met lens
- Voorbereiden weefsel voor microscopie:
Biologisch materiaal fixeren:
o Denaturerende stoffen (bv formaldehyde)
o Voor EM (= elektronenmicroscopie): materiaal harder zijn → sterkere fixerende
stoffen (bv glutaraldehyde)
o Immersiefixatie of perfusiefixatie:
▪ Immersiefixatie: bv biopsie van tumor in fixatief gebracht
▪ Perfusiefixatie: via bloedsomloop fixatief inbrengen (bij proefdieren)
→ Maakt weefsel harder maar nog niet hard genoeg (dus inbedden = weefsel
omgeven met iets anders)
Inbedden:
o In paraffine
o In harsen voor EM
o Invriezen van weefsel: snellere + duurdere mogelijkheid
Snijden van coupes met:
o Microtoom
o Ultramicrotoom (100 nm)
o Vriesmicrotoom
- Aantonen van eiwitten, lipiden, suikers
Kleuringen:
o Histochemisch (bv H&E kleuring)
o Enzymatisch
o Immunocytochemie: te maken met cellen (in cultuur)
o Immunohistochemisch (gelijkaardig met western blot ELISA): te maken met coupes
▪ Enzymatische reactie met vorming van kleurstof
▪ Fluorescentie
• Fluorescentiemicroscopie: van zichtbaar licht 1 bepaalde golflengte
geselecteerd + valt in op preparaat + licht met lagere E en hogere
golflengte afgescheiden
• Confocale microscopie: licht van onder/boven preparaat naar
detector gestuurd = onscherp beeld, dus enkel licht dat
teruggekaatst wordt + door opening kan gedetecteerd = scherper
o Andere toepassingen van fluorescentiemicroscopie: visualisatie van levende cellen
in cultuur met fluorescente probes
▪ Geen fixatie preparaat
1
, ▪ Fluorescente merker (stoffen die enkel door bepaalde celorganellen
opgenomen)
• Toegediend aan medium + door cellen opgenomen
• In cellen tot expressie gebracht
▪ Fluorescentie microscopie: camera in microscoop + kijken in tijd waar
organel zit
o Immunogold: gebruikt voor EM: aan secundaire antistoffen goudpartikel
hechten + lichten op in EM
- Aantonen van RNA
o In situ hybridisatie
- Aantonen van DNA
o FISH = fluorescent in situ hybridisation
Celweek
- Bacteriën: cellen schudden tijdens kweek voor zuurstof
- Gisten: cellen schudden tijdens kweek voor zuurstof
- Zoogdiercellen:
1) Primaire culturen:
o Uit proefdier (bv levercellen, huidcellen, hersencellen, … isoleren)
o Uit mens (bv huidcellen, endotheelcellen, … isoleren)
→ Cellen losmaken van ECM = juncties breken: enzymes nodig (bv collagenase of EDTA:
bindt calcium (calcium essentieel voor cadherinesjuncties + desmosomen))
→ Gaan niet delen + beperkt houdbaar + specifieke karakteristieken verliezen
2) Cellijnen:
o Door immortaliseren van een primaire cultuur: in geïsoleerde
primaire cellen oncogen inbrengen door transfectie → cellen
blijven delen
o Uitgaande van tumor: tumorcel isoleren + blijven delen bv Hela
cellen (baarmoederhalskanker)
→ Blijven delen + kunnen invriezen
→ Naast glucose, AZ, lipiden, ook groeifactoren nodig om zoogdiercellen te
kweken + eigenschappen te bewaren
→ Groeifactoren duur + toegediend onder vorm van serum (= bloed waarvan
bloedcellen verwijderd zijn + veel groeifactoren nog inzitten bv uit (foetaal)
kalf)
→ Medium = buffermengsel: kleur indicatie (zuur) pH (+ moet vervangen worden) (wordt
zuur doordat cellen CO2 produceren)
→ Zoogdiercellen in laminaire flowcast om contaminatie tegen te gaan: constante flow +
ruimte onder flow = steriel
H1: sorteren van eiwitten
Eiwitten hebben ‘label’/adres of “targeting sequence” in primaire sequentie (voor- of achteraan)
Eiwit geen label → “default”: eiwit komt in cytosol terecht
Synthese van translatie eiwitten op ribosomen: 2 grote wegen
1) Eerste weg: mitochondriën, peroxisomen en nucleus (kern)
2) Secretorische weg: voornamelijk stoffen die afgescheiden worden door cel
Mitochondriën
- 2 membranen
- 4 compartimenten:
1) Buitenste membraan
2) Intermembranaire ruimte
3) Binnenste membraan
4) Matrix
2
,Eiwitten meestal enzymen in matrix → niet zomaar door membraan zonder E:
Import van matrixeiwitten:
- Signaal aan positieve N-terminus:
o Van 20 – 50 AZ lang:
▪ Hydrofobe AZ
▪ Positief geladen basische AZ
▪ Gehydroxyleerde AZ
- Eiwitten niet gevouwen, maar na synthetisatie neiging om te vouwen in waterig
omgeving van cytosol → andere eiwitten bij te pas => chaperones (Hsp70)
- Tom (= Translocator outer mitochondrial membrane)
- Tim (= Translocator inner mitochondrial membrane)
- Import:
Eiwit ontvouwen door binding aan chaperone + gaat door kanaaltje van buitenste
membraan gevormd door Tom eiwitten → doorheen binnenste membraan met
kanaaltje gevormd door Tim eiwitten + in matrix: signaalsequentie (positieve N-terminus)
afgesplitst door protease en eiwit kan vouwen
o Mogelijk als kanaaltje Tom in verlengde ligt van kanaaltje Tim (kan niet op
om even welke plaats (1000tal plaatsen waar deze contacten aanwezig zijn)
o Vergt E voor:
▪ Binding chaperone om eiwit in ontvouwen toestand te houden
▪ Motoreiwit dat eiwit door binnenste mitochondriale membraan
trekt: chemische ATP → mechanische E om binnenkomende
eiwitstreng vastnemen + eiwit naar binnen
▪ Potentiaalverschil over binnenste membraan: kost E om
spanningsverschil op te bouwen
• Buitenkant positief
• Binnenkant negatief
→ helpt om positieve eiwit naar binnen te trekken
- Membraaneiwitten:
1) Eiwit opzijgeschoven (deels in matrix, deels in intermembranaire ruimte)
a. Doorheen buitenste + deels doorheen binnenste membraan
b. Volledig door binnenste (signaalsequentie afgesplits) + terug
naar kanaal en opzijgeschoven
2) Volledig in intermembranaire ruimte (tussen 2 membranen):
a. Doorheen buitenste
b. Doorheen buitenste + binnenste (signaalsequentie afgesplitst) en dan terug
door kanaal in intermembranaire ruimte
- Voorbeeld belang mitochondriaal import:
Vorm nierkanker → mutatie enzym dat DNA-sequenties herstelt = problemen in
signaalsequentie
2 signalen:
1) NLS (= Nucleair localisatie signaal)
2) MTS (= Mitochrondiaal targeting signaal): vooraan eiwitsequentie + door
alternatieve splicing al dan niet aanwezig
→ Eiwit ofwel in mitochondriën of kern terechtkomen, maar bij defect targeting sequence:
andere AZ bv G vervangen door E → negatieve lading stoort positieve eigenschap eiwit: komt
niet in mitochondriën terecht => aanleiding mitochondriaal DNA niet beschermt + bijdrage
ontstaan nierkanker
3
, Peroxisomen
- Organellen omgeven door enkelvoudige membraan
- Aanwezig in (alle) eukaryote cellen: niet in rode bloedcellen
- Variëren in vorm, grootte, aantal naargelang celtype
- “microbodies”
- Matrixeiwitten → weer 2 signaalsequenties mogelijk:
1) PTS2: N-terminus
2) PTS1 (= Peroxisoom targeting signaal 1):
▪ C-terminus (uiteinde eiwit)
▪ 3 AZ (voldoende om eiwit naar peroxisomen te brengen)
▪ Consensus = SKL (Serine, Lysine, Leucine): meest
voorkomend signaal (≠ altijd zelfde signaal: wel
AZ met altijd zelfde eigenschappen bv lysine
niet vervangen door zuur/hydrofoob AZ)
- Import van PTS1 eiwitten:
Pex5-receptor herkent PTS1-sequentie aan carboxyl-uiteinde in cytosol + pex5 affiniteit
voor pex14-membraaneiwit en bindt
o Hoe eiwit in membraan? = nog niet zeker: pex14 maakt tijdelijk kanaaltje?
o Mutatie (in pex14, 10 of 5) → ernstige ziekten: sterven binnen 1ste levensjaar
Kern
- Import en export
- Dubbele membraan
- Grote poriën = Nuclear pore complex
o Onderbreekt dubbele mebraan
o Nuclear basket:
▪ Complex met 100 eiwitten gericht naar
• Cytoplasma: eiwitten naar porie brengen
• Nucleus/kern (structuur lijkt op basket)
o Kleine moleculen/ionen via poriën vrij verplaatsen:
diffunderen (passieve diffusie)
o Grote (eiwitten) kost E
- Import (van cytosol naar kern):
Eerst eiwitten tot transcriptie in kern + dan naar cytosol om tot translatie komen + terug in kern:
eiwit met nucleair localisatiesignaal bindt aan eiwit importine + contact met ‘eiwitdraadjes’ op
nuclear basket → doorheen kanaaltje: eiwit-importinecomplex grote affiniteit => eiwit
Ran/GTP bindt met importine + eiwit komt los in kern + Ran/GTP – importine
getransporteerd naar cytosol en GTP zet fosfaat af = Ran/GDP + importine komt vrij in
cytosol → Ran/GDP terug naar kern + terug gerecycleerd tot Ran/GTP
o Bv bij: Transcriptiefactoren, polymerasen, …
o Ran = small GTP binding protein (wisselt tussen GTP/GDP gebonden vorm)
o Nucleair localisatiesignaal:
▪ Positieve AZ (Bv Lys, Arg)
▪ Niet aan N- of C-terminus maar binnenin met eventueel “onderbrekingen”
▪ “Onderbrekingen”: localisatiesignaal AZ verspreid MAAR stukjes
noodzakelijk + voldoende anders geen signaal
- Export (van kern naar cytosol):
Eiwit met NES bindt aan eiwit exportine en aan Ran/GTP + via nuclear basket naar cytoplasma
→ Ran/GTP gesplitst + E komt vrij en eiwit komt los van complex + exportine en Ran/GDP
terug gerecycleerd naar kern
o NES = Nuclear export signal
4
