Weefsellleer – Histologische technieken
Inleiding - Cellen & weefsels
Cytologie & histologie
Cytologie Alles over de cel (kleiner dan blote oog) Microscopisch niveau
Histologie Alles over weefsel (zichtbaar met blote oog) Macroscopisch niveau
Algemeen – Histologische technieken
• Doel: zaken observeerbaar maken voor LM of EM
o MAAR: te weinig contrast of te weinig licht (doorlaatbaarheid) om alles goed te zien
➢ Oplossing: bewerken
• Stappen van bewerken
1. Fixeren
2. Inbedden
3. Snijden
4. Kleuren of contrasten
Weefselbewerking
Stap 1: fixeren
• Doel: behouden van structuur door te denatureren (=vervormen zodat hun werking stop gezet wordt),
onderdompelen in een fixatievloeistof
o Membraan permeabiliseren
o Harder en poreuzer maken
• Methode
o Chemisch fixeren met oa ethanol, formaldehyde, …
▪ Immersie: onderdompelen
▪ Perfusie: inspuiten in bloedvaten
o Koud fixeren: invriezen van weefsel (sneller, maar slechter)
! Ontstaan artefacten: verandering in weefsel, afwijkend van in vivo
Stap 2: inbedden
• Doel: Gefixeerd materiaal doordringen met inbedmiddel om zo fijner te snijden
• Kenmerken inbedmiddel
o Vloeibare stof die na indringen verhard zodat je materiaal in dunnere coupes kunt snijden
o Stoffen: paraffine, harsen, plastics
• Probleem: inbedmiddelen zijn hydrofoob, en weefsel bevatten veel water
o Oplossing 1: Weefsel ontwater in stijgende reeksen van alcoholbaden tot absoluut ethanol
! MAAR dit mengt nog altijd niet met inbedmiddel
o Oplossing 2: Clearing in tolueen (mengbaar met zowel alcohol als inbedmiddel)
,Stap 3: snijden
• Doel: snijden van coupe in dunne plakjes
• Hardheid van inbedmateriaal bepaald de dikte
o Paraffine: stalen mes (5𝜇m)
o Harsen en plastics: glazen of diamanten mes
▪ Halfdun: 50nm -2𝜇m > LM
▪ Dun: 70nm > EM (veel kleiner, duuder, ZW)
Stap 4: kleuren (LM) of contrasteren (EM)
Kleuren = lichtmicroscoop
LM = helderveld LM = bright field LM
• Doel: duidelijker visualiseren van alle deeltjes
• Methode: men stuurt wit licht door een weefsel via een glazen lens, een deel wordt geabsorbeerd en een
ander deel wordt gereflecteerd (zichtbaar!)
o Probleem: kleurstoffen zijn vaak waterige stoffen > deparaffineren met tolueen
1 HE-kleuring
= door middel van zure en basische kleurstoffen stoffen bekijken met zure of basische bestanddelen
➢ Zure weefselgroepen: carbonzuren, fosfaten, sulfaten (EW, DNA/RNA, glycanen)
➢ Basische weefselgroepen: amines
➢ Amfolyten: zowel basische als zure kenmerken (VOORBEELD: AZ)
! pH van milieu is bepalend voor resultaat > belang van iso-elektrisch punt (IEP)
• Kleurstoffen kunnen basisch of zuur zijn
Base Haematoxyline (blauw) VOORBEELDEN
Basische kleurstof celkernen
➢ Reageert bij zure bestanddelen
Zuur Eosine (roze) VOORBEELDEN
Zure kleurstoffen cytoplasma
➢ Reageren bij basische bestanddelen
amfoliet Beide componenten bestaan (paars) VOORBEELDEN
➢ Reageren bij Z/B bestanddelen Aminozuren
HE kleuring is niet altijd de beste keuze
• Sachariden kleuren niet
o Metachromasie: cellen zitten zo dicht op elkaar dat ze plakken en foute kleuring weergeven
▪ Bepaalde weefsels kleuren niet blauw, maar rood/roze door de vorming van dimeren tussen
kleurstofmoleculen
• Lipiden of vetten krijgen een foute kleuring
o Vetten los op in alcohol > zedelringen (artefact)
▪ Oplossing bij LM: vetoplosbare kleurstoffen zoals ‘Soudan Black’ bij vriescoupes
▪ Oplossing bij EM: OsO4 bindt met vetzuur waardoor ze zichtbaar worden
2 PAS-kleuring
Aantonen van specifieke groep: polysachariden, oa mucines
• Principe:
o Oxidatie: glycolgroep > aldehyde
o aldehyde reageert met shiff-reagens > paarsrode kleur
• vaak gebruikt voor Lumen, goblet cells
,3 Feulgen-kleuring
Aantonen van specifieke groep: DNA
• principe: ontstaan aldehyde die gaat reageren met shiff-reagens > paarsrode kleur
4 Enzymhistochemie
Visualiseren van enzymatische activiteit
• principe: toevoegen specifiek substraat > neerslagvorming die weinig licht doorlaat
o typische donkere vlekken
5 Autoradiografie
Visualiseren van metabole activiteit
• principe: toevoegen radioactief gemerkte precursor > coupes in contact met fotografische emulsie
• VOORBEELD: Bij het aantonen van DNA-synthese in cellen wordt een overmaat 3H-thymidine aan DNA
toegevoegd die vervolgens als radioactief wordt gelabeld
6 Immuohistochemie (IH)*
Visualiseren van specifieke moleculen in antilichaam (AL)
• Principe: AL voorzien van een merker voor LM,EM of FM
o Direct: labeld AL bindt op antigeen die je wil aantonen > 1 specifiek signaal
o Indirect: 2 stappen
▪ Unlabeld primary AL bindt op antigeen die je wil aantonen en vormt een binding
▪ Labeld secondary AL bindt op deze binding en vormt een complexe binding > veel signalen
7 In situ hybridisatie (ISH)*
Visualiseren van specifieke NT volgorde in DNA/RNA
• Principe: adhv DNA/RNA probes die je voorziet van een merker
*IH en ISH zijn vaak fluorescerende merkers gebruikt in fluorescentie microscopie (FM),
een speciale vorm van LM die gebruik maakt van filters om excitatielicht om te zetten van korte naar lange golflengte.
Hier heb je achtergrond kleuring nodig. Confocale microscopie is een betere type van FM die met diepte speelt.
Contrasteren = elektronenmicroscopie
1 Transmissie EM (TEM) & Scanning EM (SEM)
Visualiseren van cellen, cel bestanddelen en extracellulaire materiaal
➢ TEM: kijkt door monster geen
➢ SEM: scant het oppervlak (3D)
• Principe: het weefsel bestralen met een elektronenbundel van eenzelfde golflengte, via magneetspoel
o Elektronenverstrooiing door weefsel
▪ Doorlaten: zwarting op negatief > lichte kleur
▪ Niet doorlaten: zwarting op positief > donkere/zwarte kleur
, • Probleem: weinig densiteitverschillen
o Oplossing: densiteit verhogen dmv zware metalen (contrasteren)
o Voorbeelden zware metalen:
▪ OsO4: zwarting membranen
▪ Uranylacetaat: zwarting NZ & EW
▪ Loodcitraat: zwarting NZ
▪ Contrasteringsvloeistof uit uranylacetaat & loodcitraat
2 Immuohistochemie (IH)
Visualiseren van specifieke moleculen in anti-lichaam (AL)
• Principe: AL voorzien van een merker voor LM,EM of FM
o Direct (1 signaal) of indirect (veel signalen)
Observatiemethoden
Lichtmicroscoop (LM)
• Bron: zichtbaar licht
o Geabsorbeerd <> gereflecteerd (zien!)
• Kleuren via kleurstoffen om onderdelen beter te zien
! Cellen in labo kun je niet kleuren: fase plaatjes ertussen steken
o Helderveld: zonder fase
o Fasecontrast: aflijning en contouren van de cel
o Interferentiecontrast: diepte van de cel (3D)
• Vergroting
o Oculair en objectieflens: 4x, 10x, 40x, 100x
o Maximaal: 1000x
Resolutie of scheidend vermogen
= kleinste afstand tussen 2 punten om ze als 2 aparte punten te zien
➢ LM: max 250 nm
Elektronenmicroscoop (EM)
• Bron: elektronenbundel met korte golflengte
o Elektronenbundel door magneetspoel sturen > beeldvorming
▪ fluorescerend scherm
▪ fotografische plaat
▪ digitale camera
• Contrasteren met zware metalen
• Vergroting: tot 100.000x
• Resolutie: 2-3nm
Virtuele microscoop
Preparaten die worden ingescand op 40x, zo krijg je een beeld op de computer (iedereen gelijk). Je kan makkelijk
zoomen en navigeren. Via het programma kan je ook zaken labelen.
Inleiding - Cellen & weefsels
Cytologie & histologie
Cytologie Alles over de cel (kleiner dan blote oog) Microscopisch niveau
Histologie Alles over weefsel (zichtbaar met blote oog) Macroscopisch niveau
Algemeen – Histologische technieken
• Doel: zaken observeerbaar maken voor LM of EM
o MAAR: te weinig contrast of te weinig licht (doorlaatbaarheid) om alles goed te zien
➢ Oplossing: bewerken
• Stappen van bewerken
1. Fixeren
2. Inbedden
3. Snijden
4. Kleuren of contrasten
Weefselbewerking
Stap 1: fixeren
• Doel: behouden van structuur door te denatureren (=vervormen zodat hun werking stop gezet wordt),
onderdompelen in een fixatievloeistof
o Membraan permeabiliseren
o Harder en poreuzer maken
• Methode
o Chemisch fixeren met oa ethanol, formaldehyde, …
▪ Immersie: onderdompelen
▪ Perfusie: inspuiten in bloedvaten
o Koud fixeren: invriezen van weefsel (sneller, maar slechter)
! Ontstaan artefacten: verandering in weefsel, afwijkend van in vivo
Stap 2: inbedden
• Doel: Gefixeerd materiaal doordringen met inbedmiddel om zo fijner te snijden
• Kenmerken inbedmiddel
o Vloeibare stof die na indringen verhard zodat je materiaal in dunnere coupes kunt snijden
o Stoffen: paraffine, harsen, plastics
• Probleem: inbedmiddelen zijn hydrofoob, en weefsel bevatten veel water
o Oplossing 1: Weefsel ontwater in stijgende reeksen van alcoholbaden tot absoluut ethanol
! MAAR dit mengt nog altijd niet met inbedmiddel
o Oplossing 2: Clearing in tolueen (mengbaar met zowel alcohol als inbedmiddel)
,Stap 3: snijden
• Doel: snijden van coupe in dunne plakjes
• Hardheid van inbedmateriaal bepaald de dikte
o Paraffine: stalen mes (5𝜇m)
o Harsen en plastics: glazen of diamanten mes
▪ Halfdun: 50nm -2𝜇m > LM
▪ Dun: 70nm > EM (veel kleiner, duuder, ZW)
Stap 4: kleuren (LM) of contrasteren (EM)
Kleuren = lichtmicroscoop
LM = helderveld LM = bright field LM
• Doel: duidelijker visualiseren van alle deeltjes
• Methode: men stuurt wit licht door een weefsel via een glazen lens, een deel wordt geabsorbeerd en een
ander deel wordt gereflecteerd (zichtbaar!)
o Probleem: kleurstoffen zijn vaak waterige stoffen > deparaffineren met tolueen
1 HE-kleuring
= door middel van zure en basische kleurstoffen stoffen bekijken met zure of basische bestanddelen
➢ Zure weefselgroepen: carbonzuren, fosfaten, sulfaten (EW, DNA/RNA, glycanen)
➢ Basische weefselgroepen: amines
➢ Amfolyten: zowel basische als zure kenmerken (VOORBEELD: AZ)
! pH van milieu is bepalend voor resultaat > belang van iso-elektrisch punt (IEP)
• Kleurstoffen kunnen basisch of zuur zijn
Base Haematoxyline (blauw) VOORBEELDEN
Basische kleurstof celkernen
➢ Reageert bij zure bestanddelen
Zuur Eosine (roze) VOORBEELDEN
Zure kleurstoffen cytoplasma
➢ Reageren bij basische bestanddelen
amfoliet Beide componenten bestaan (paars) VOORBEELDEN
➢ Reageren bij Z/B bestanddelen Aminozuren
HE kleuring is niet altijd de beste keuze
• Sachariden kleuren niet
o Metachromasie: cellen zitten zo dicht op elkaar dat ze plakken en foute kleuring weergeven
▪ Bepaalde weefsels kleuren niet blauw, maar rood/roze door de vorming van dimeren tussen
kleurstofmoleculen
• Lipiden of vetten krijgen een foute kleuring
o Vetten los op in alcohol > zedelringen (artefact)
▪ Oplossing bij LM: vetoplosbare kleurstoffen zoals ‘Soudan Black’ bij vriescoupes
▪ Oplossing bij EM: OsO4 bindt met vetzuur waardoor ze zichtbaar worden
2 PAS-kleuring
Aantonen van specifieke groep: polysachariden, oa mucines
• Principe:
o Oxidatie: glycolgroep > aldehyde
o aldehyde reageert met shiff-reagens > paarsrode kleur
• vaak gebruikt voor Lumen, goblet cells
,3 Feulgen-kleuring
Aantonen van specifieke groep: DNA
• principe: ontstaan aldehyde die gaat reageren met shiff-reagens > paarsrode kleur
4 Enzymhistochemie
Visualiseren van enzymatische activiteit
• principe: toevoegen specifiek substraat > neerslagvorming die weinig licht doorlaat
o typische donkere vlekken
5 Autoradiografie
Visualiseren van metabole activiteit
• principe: toevoegen radioactief gemerkte precursor > coupes in contact met fotografische emulsie
• VOORBEELD: Bij het aantonen van DNA-synthese in cellen wordt een overmaat 3H-thymidine aan DNA
toegevoegd die vervolgens als radioactief wordt gelabeld
6 Immuohistochemie (IH)*
Visualiseren van specifieke moleculen in antilichaam (AL)
• Principe: AL voorzien van een merker voor LM,EM of FM
o Direct: labeld AL bindt op antigeen die je wil aantonen > 1 specifiek signaal
o Indirect: 2 stappen
▪ Unlabeld primary AL bindt op antigeen die je wil aantonen en vormt een binding
▪ Labeld secondary AL bindt op deze binding en vormt een complexe binding > veel signalen
7 In situ hybridisatie (ISH)*
Visualiseren van specifieke NT volgorde in DNA/RNA
• Principe: adhv DNA/RNA probes die je voorziet van een merker
*IH en ISH zijn vaak fluorescerende merkers gebruikt in fluorescentie microscopie (FM),
een speciale vorm van LM die gebruik maakt van filters om excitatielicht om te zetten van korte naar lange golflengte.
Hier heb je achtergrond kleuring nodig. Confocale microscopie is een betere type van FM die met diepte speelt.
Contrasteren = elektronenmicroscopie
1 Transmissie EM (TEM) & Scanning EM (SEM)
Visualiseren van cellen, cel bestanddelen en extracellulaire materiaal
➢ TEM: kijkt door monster geen
➢ SEM: scant het oppervlak (3D)
• Principe: het weefsel bestralen met een elektronenbundel van eenzelfde golflengte, via magneetspoel
o Elektronenverstrooiing door weefsel
▪ Doorlaten: zwarting op negatief > lichte kleur
▪ Niet doorlaten: zwarting op positief > donkere/zwarte kleur
, • Probleem: weinig densiteitverschillen
o Oplossing: densiteit verhogen dmv zware metalen (contrasteren)
o Voorbeelden zware metalen:
▪ OsO4: zwarting membranen
▪ Uranylacetaat: zwarting NZ & EW
▪ Loodcitraat: zwarting NZ
▪ Contrasteringsvloeistof uit uranylacetaat & loodcitraat
2 Immuohistochemie (IH)
Visualiseren van specifieke moleculen in anti-lichaam (AL)
• Principe: AL voorzien van een merker voor LM,EM of FM
o Direct (1 signaal) of indirect (veel signalen)
Observatiemethoden
Lichtmicroscoop (LM)
• Bron: zichtbaar licht
o Geabsorbeerd <> gereflecteerd (zien!)
• Kleuren via kleurstoffen om onderdelen beter te zien
! Cellen in labo kun je niet kleuren: fase plaatjes ertussen steken
o Helderveld: zonder fase
o Fasecontrast: aflijning en contouren van de cel
o Interferentiecontrast: diepte van de cel (3D)
• Vergroting
o Oculair en objectieflens: 4x, 10x, 40x, 100x
o Maximaal: 1000x
Resolutie of scheidend vermogen
= kleinste afstand tussen 2 punten om ze als 2 aparte punten te zien
➢ LM: max 250 nm
Elektronenmicroscoop (EM)
• Bron: elektronenbundel met korte golflengte
o Elektronenbundel door magneetspoel sturen > beeldvorming
▪ fluorescerend scherm
▪ fotografische plaat
▪ digitale camera
• Contrasteren met zware metalen
• Vergroting: tot 100.000x
• Resolutie: 2-3nm
Virtuele microscoop
Preparaten die worden ingescand op 40x, zo krijg je een beeld op de computer (iedereen gelijk). Je kan makkelijk
zoomen en navigeren. Via het programma kan je ook zaken labelen.
