Fundamenteel en toegepast biomedisch eiwitonderzoek
Chapter 1: Protein chemistry in contemporary biomedical research
1. About proteins, their transcripts and their genes
Genoom = alle info om eiwitten te bouwen = alle genen samen = ongeveer 20.000
coderende genen
Proteoforms = eiwittranscripten
CENTRAAL DOGMA: 1 gen = 1 transcript = 1 eiwit => FOUT!!! (splicing en modificatie zorgt
voor meerdere transcripten)
1 domein = ongeveer 100 AZn
1 eiwit = meerdere domeinen
1ste AZ = N-terminus
Niet coderende genen > coderende genen
=> splicing
=> transcripten
Proteoom = alle eiwn samen in een cel, weefsel of organisme = zeer complex
= bepaald adhv affiniteitschromatografie
met antilichamen, meest voorkomende/
abundante eerst verwijderd
Meest: histonen, ribosomen, actine,...
=> hoge intensiteit op
Op SDS/chromatografie
Minst: cyclines
=> lage intensiteit op
Op SDS/chromatografie
Modificatie = wijziging van AZn (formule afh van aantal modifiacties per AZ)
Inactief mRNA afh van:
- Lengte poly A-staart
- MicroRNA's (= verstoren translatie)
Actief eiwit afh van:
- Omgeving
- Structuur (chaperonen)
- Modificaties
Proteasoom = ubiqiutinatie = teveel/fout opgevouwen eiwitten verwijderen =
RECYCLAGEFABRIEK
Mutatie = mRNA, maar aantal eiwn blijft gelijk want meerdere
controlesystemen (slide 9)
SAMSSON = lncRNA, kan je verwijderen door size exclusion chromatografie
, AUG = start van translatie, maar in 75% van de gevallen kan ook .....UG zijn
Signaalpeptide = hydrofoob; op N-terminus
=> bepalen ‘adres’ van eiwit; proteasen op de locatie herkennen het pepetide en
weten dat het eiwit op
de juiste plaats aanwezig is
NX (S/T/C) X ≠ P
Glycosylatieformule: glycosylatie aspargine, maar enkel als het op het opp zit
Post translationele modificaties worden vaak voorspeld met programma’s => maar niet te
vertrouwen
2. Proteins in the field of biomedical sciences
= soms gebruikt in vaccins: cholera, hepatitis B
gemuteerde eiwitten = bv. Protease (herkent substraat en knipt het in 2) => ligase (herkent
2 substraten en plakt ze aan elkaar)
Chapter 2: The amino acids
1. Algemeen
- Eiwitten kunnen een D- en L- vorm hebben, L is meest voorkomend
- Het zijn zwitterionen = negatieve en positieve lading tegelijk aanwezig maar algemeen
neutraal => ladingen afh van de pH
- Aminozuren gebonden door peptidebinding = carboxyl en aminogroep binden + H2O
komt vrij
- Voorgesteld = op verschillende manieren afh van wat je wil aantonen
- 1 en 3 lettercode + structuur kunnen + pka waarden kennen
- Glycine = geen assymetrie => geen L- en D vormen
1.1. Soorten aminozuren
Alfatische aminozuren: alanine, valine, leucine en isoleucine = vaak aan
binnenkant voor hydrofoob karakter, kan ook aan buitenkant (hebben alleen
koolstoffen en aterstoffen in de zijketen)
Cyclisch aminozuur = proline
Aromatische aminozuren: phenylalanine, tyrosine en tryptofaan, laatse 2 kunnen
UV-licht opvangen => verandering in fluorescentie = verandering in het aminozuur
Hydroxyl aminozuren: serine en threonine: waterstof donor en acceptor
Zure aminozuren: aspargaanzuur en glutamaat zuur, pH > 5 = geïoniseerd
Amide bevattende aminozuren: asparagine en glutamine,
Basische aminozuren: lysine, arginine en histidine, arginine vaak positief geladen
en histidine heeft een imidazole ring
Sulfide aminozuren: methionine en cysteïne, cysteïne vormt vaak disulfidebruggen
2. Eiwitmodificaties
= door enzymes of chemisch geïntroduceerd
Cotranslationaal: wanneer de ribosomen nog aan het synthetiseren zijn
Posttranslationaal: na translatie
RESID = databank met alle modificaties in
, 2.1. N-terminale acetylatie
N-alpha terminal acetyltransferase (NAT) zet een acetylgroep van acetyl-coenzyme A
op alfa-aminogroep van de polypeptide
Er bestaan meerdere NAT’s de een al specifieker dan de ander
Stabiliteit van een eiwit: bepaald door modificatie en eigenschap van N-terminaal
aminozuur
Functionele gevolgen modificatie:
- Verwijdering positieve lading = stijging hydrofobiciteit
- Eiwit-eiwit interacties
- Eiwit opvouwing
- N- end rule: aminozuur op einde bepaald stabiliteit
NAA10 syndroom = ontwikkelingsstoornis en daling stabiliteit
2.2. Omkeerbare fosforylatie
= activatie of inhibitie eiwit afh van welk AZ gefosforyleerfd wordt
O-phosphomonoesters: Ser, Thr en Tyr
N-phosphoramidates: Arg, Lys en His
S-phosphothioesters: Cys
Phosphoanhydrides: Glu en Asp
Proteïne kinase = fosfaatgroep (ATP => ADP) binden op een molecule die nu negatief
geladen wordt
=> vaak gemuteerd en/of overgeëxpreseerd in kanker of tumor = gebruik als drugs
target
Fosfatase = haalt fosfaatgroep er terug af
Je hebt er meerdere in elkaars buurt nodig = fosforylatie = signaal (Ser>Thr>Tyr)
2.3. Acetylatie van lysine zijketen
= heel veel soorten modificatie mogelijk, meeste zijn omkeerbaar
= lysine acetyltransferase (KATs) zetten acetyl van acetyl-coenzyme A op amino-
groep
Massaspectrometrie: manier om modificaties te achterhalen, modificatie = hogere
massa (je weet wel niet welke modificiatie het is)
Antilichamen: kunnen ook modificaties aantonen als ze specifiek op de
gemodificeerde groep binden
Hypergeacetyleerde chromatine: actieve transcriptie
Hypogeacetyleerde chromatine: inactieve genen
2.4. Ubiquitinatie
E1: enzym dat bindt in katalytisch centrum = activatie E2, ATP nodig => er is een
overzet van ubiquitinatie naar actieve site van E1 met vrijkomst AMP
E2: enzym, ubiqiutine wordt hier naar overgebracht
E3: ligase die bv. Op substraat bindt
=> zeer sterk gereguleerd, want enkel foute eiwitten vlaggen en naar proteasoom
sturen
Locatie van ubiquitinatie zorgt voor verschillende uitkomsten => niet altijd
proteasoom (zie slide 12)
Chapter 1: Protein chemistry in contemporary biomedical research
1. About proteins, their transcripts and their genes
Genoom = alle info om eiwitten te bouwen = alle genen samen = ongeveer 20.000
coderende genen
Proteoforms = eiwittranscripten
CENTRAAL DOGMA: 1 gen = 1 transcript = 1 eiwit => FOUT!!! (splicing en modificatie zorgt
voor meerdere transcripten)
1 domein = ongeveer 100 AZn
1 eiwit = meerdere domeinen
1ste AZ = N-terminus
Niet coderende genen > coderende genen
=> splicing
=> transcripten
Proteoom = alle eiwn samen in een cel, weefsel of organisme = zeer complex
= bepaald adhv affiniteitschromatografie
met antilichamen, meest voorkomende/
abundante eerst verwijderd
Meest: histonen, ribosomen, actine,...
=> hoge intensiteit op
Op SDS/chromatografie
Minst: cyclines
=> lage intensiteit op
Op SDS/chromatografie
Modificatie = wijziging van AZn (formule afh van aantal modifiacties per AZ)
Inactief mRNA afh van:
- Lengte poly A-staart
- MicroRNA's (= verstoren translatie)
Actief eiwit afh van:
- Omgeving
- Structuur (chaperonen)
- Modificaties
Proteasoom = ubiqiutinatie = teveel/fout opgevouwen eiwitten verwijderen =
RECYCLAGEFABRIEK
Mutatie = mRNA, maar aantal eiwn blijft gelijk want meerdere
controlesystemen (slide 9)
SAMSSON = lncRNA, kan je verwijderen door size exclusion chromatografie
, AUG = start van translatie, maar in 75% van de gevallen kan ook .....UG zijn
Signaalpeptide = hydrofoob; op N-terminus
=> bepalen ‘adres’ van eiwit; proteasen op de locatie herkennen het pepetide en
weten dat het eiwit op
de juiste plaats aanwezig is
NX (S/T/C) X ≠ P
Glycosylatieformule: glycosylatie aspargine, maar enkel als het op het opp zit
Post translationele modificaties worden vaak voorspeld met programma’s => maar niet te
vertrouwen
2. Proteins in the field of biomedical sciences
= soms gebruikt in vaccins: cholera, hepatitis B
gemuteerde eiwitten = bv. Protease (herkent substraat en knipt het in 2) => ligase (herkent
2 substraten en plakt ze aan elkaar)
Chapter 2: The amino acids
1. Algemeen
- Eiwitten kunnen een D- en L- vorm hebben, L is meest voorkomend
- Het zijn zwitterionen = negatieve en positieve lading tegelijk aanwezig maar algemeen
neutraal => ladingen afh van de pH
- Aminozuren gebonden door peptidebinding = carboxyl en aminogroep binden + H2O
komt vrij
- Voorgesteld = op verschillende manieren afh van wat je wil aantonen
- 1 en 3 lettercode + structuur kunnen + pka waarden kennen
- Glycine = geen assymetrie => geen L- en D vormen
1.1. Soorten aminozuren
Alfatische aminozuren: alanine, valine, leucine en isoleucine = vaak aan
binnenkant voor hydrofoob karakter, kan ook aan buitenkant (hebben alleen
koolstoffen en aterstoffen in de zijketen)
Cyclisch aminozuur = proline
Aromatische aminozuren: phenylalanine, tyrosine en tryptofaan, laatse 2 kunnen
UV-licht opvangen => verandering in fluorescentie = verandering in het aminozuur
Hydroxyl aminozuren: serine en threonine: waterstof donor en acceptor
Zure aminozuren: aspargaanzuur en glutamaat zuur, pH > 5 = geïoniseerd
Amide bevattende aminozuren: asparagine en glutamine,
Basische aminozuren: lysine, arginine en histidine, arginine vaak positief geladen
en histidine heeft een imidazole ring
Sulfide aminozuren: methionine en cysteïne, cysteïne vormt vaak disulfidebruggen
2. Eiwitmodificaties
= door enzymes of chemisch geïntroduceerd
Cotranslationaal: wanneer de ribosomen nog aan het synthetiseren zijn
Posttranslationaal: na translatie
RESID = databank met alle modificaties in
, 2.1. N-terminale acetylatie
N-alpha terminal acetyltransferase (NAT) zet een acetylgroep van acetyl-coenzyme A
op alfa-aminogroep van de polypeptide
Er bestaan meerdere NAT’s de een al specifieker dan de ander
Stabiliteit van een eiwit: bepaald door modificatie en eigenschap van N-terminaal
aminozuur
Functionele gevolgen modificatie:
- Verwijdering positieve lading = stijging hydrofobiciteit
- Eiwit-eiwit interacties
- Eiwit opvouwing
- N- end rule: aminozuur op einde bepaald stabiliteit
NAA10 syndroom = ontwikkelingsstoornis en daling stabiliteit
2.2. Omkeerbare fosforylatie
= activatie of inhibitie eiwit afh van welk AZ gefosforyleerfd wordt
O-phosphomonoesters: Ser, Thr en Tyr
N-phosphoramidates: Arg, Lys en His
S-phosphothioesters: Cys
Phosphoanhydrides: Glu en Asp
Proteïne kinase = fosfaatgroep (ATP => ADP) binden op een molecule die nu negatief
geladen wordt
=> vaak gemuteerd en/of overgeëxpreseerd in kanker of tumor = gebruik als drugs
target
Fosfatase = haalt fosfaatgroep er terug af
Je hebt er meerdere in elkaars buurt nodig = fosforylatie = signaal (Ser>Thr>Tyr)
2.3. Acetylatie van lysine zijketen
= heel veel soorten modificatie mogelijk, meeste zijn omkeerbaar
= lysine acetyltransferase (KATs) zetten acetyl van acetyl-coenzyme A op amino-
groep
Massaspectrometrie: manier om modificaties te achterhalen, modificatie = hogere
massa (je weet wel niet welke modificiatie het is)
Antilichamen: kunnen ook modificaties aantonen als ze specifiek op de
gemodificeerde groep binden
Hypergeacetyleerde chromatine: actieve transcriptie
Hypogeacetyleerde chromatine: inactieve genen
2.4. Ubiquitinatie
E1: enzym dat bindt in katalytisch centrum = activatie E2, ATP nodig => er is een
overzet van ubiquitinatie naar actieve site van E1 met vrijkomst AMP
E2: enzym, ubiqiutine wordt hier naar overgebracht
E3: ligase die bv. Op substraat bindt
=> zeer sterk gereguleerd, want enkel foute eiwitten vlaggen en naar proteasoom
sturen
Locatie van ubiquitinatie zorgt voor verschillende uitkomsten => niet altijd
proteasoom (zie slide 12)
