Biologische modelsystemen
Deel 1: Historiek, definite, criteria en mendaliaanse overerving
1. Historiek
Vroeger: observatie en beschrijving van dierenrijk
19de eeuw: embryologie
20ste eeuwn: splitsing embryologie en evolutionaire biologie
1.1. Experimentele embryologie
- Invloed beschadiging cellen in toekomst
- Cellen kleuren en volgen
- Manipuleren door transplantatie (bv. Groep die hoofd vormt ergens anders = 2
hoofden)
2. Definitie en keuze modelorganismen
Afh van wat je wil bestuderen, 6 meest gebruikte (besproken in cursus) => liggen niet verspreid
in dierenrijk
3. Criteria
Beschikbaarheid: zebravis en xenopus makkelijk in grote hoeveelheid te bekijken
Kostprijs: fruitvliegen in doosje goedkoper dan kooien van muizen
Toegankelijkheid: embryologisch onderzoek liefst buiten lichaam => kan niet altijd
Kleine lichaamsgrootte: soms materiaal te klein om mee te kunnen werken
Snelheid: bij een muis moet je veel langer wachten op een nieuwe generatie dan een fruitvlieg
Manipuleerbaarheid: hoe makkelik kan je het manipuleren buiten het lichaam
Genetica en genenkaarten:
Relevantie: muis staat dichter bij de mens dan de andere
Deel 2: Caenorhabditis elegans
= kennis uitbreiden naar meercellige organismen
1. Eigenschappen
- Klein, wijd verspreidt
- Makkelijk kweken op agarplaten
- Snelle generatietijd: 3 dagen
- Zelfbevruchtend hermafrodiet
- Vast en klein aantal cellen, wel alle germlayers, spijsverteringsstelsel, zenuwstelsel,
zintuigen, spieren, geslachtsstelsel, excretiestelsel
2. Ontwikkeling
Eerste delin => eerste larve => worm, 10% cellen deelt verder => groeit en vervelt 4 keer =>
volwassen
Ongunstige omstandigheden = slaapstadie tot betere omstandigheden
Brenner: maakte stamboom van alle cellen en hun uiteindelijke plaats, nadien volledig
delingspatroon opgesteld
2.1. Embryonale ontwikkeling
= invariant, elke cel deelt op hetzelfde moment in alle wormen samen
P0, P1, P2, P3 en P4 = germinale lijn
Mozaïekontwikkeling: alle cellen weten autonoom wat ze moeten doen en waar ze
naartoe moeten, bepaald door asymmetrische verdeling stoffen => hebben cellen
ernaast nodig om elkaar te helpen met communicatie
,3. Genoom
XX: hermafrodiet
XO: mannetje
5 chromosomen + 1 geslachtschromosoom
=> doen aan zelfbevruchting, dus minder generaties nodig om homozygote mutatie te
verkrijgen => voordeel
3.1. Kruising
Mannetjes belangrijk want homozygoten vaak lethaal en steriel dus:
- Mannetjes bewaren die heterozygoot zijn
- Mannelijk sperma voorrang bij terugkruising
- Nodig om mutatie te induceren in hermafrodiete individuen (slide 16)
3.2. Voordelen
- Snelle ontwikkeling
- Zelfbevruchting
- Genetische variatie en stocks dmv mannetjes
- Onuitputbare stock
- Manipulatie makkelijk
- Volledig genoom in kaart
4. Technieken
4.1. 4D-microscopie
Computermicroscoop = maakt 3D film van embryonale ontwikkeling
=> de celdeling kan autonoom gevolgd worden
=> opstelling delingspatroon
4.2. Laserablatie
= uitschakelen embryonale cellen met UV om signalen tussen cellen op te sporen
Laser = beschadiging van DNA = apoptose, maar hersteld soms
=> gat maken en cel eruit halen is beter
4.3. Micro-injectie
= inspuiten stof (bv. GFP en fluorescentie checken)
DNA-construct in ovaria (alle cellen zijn hier verbonden) inspuiten = nakomelingen
dragen mutant/vreemd gen
4.4. Transformatie met merkergen
= kijken welke nakomeling het ‘foute’ gen van de ouder heeft, door een merkergen naast
het foute gen te implementeren
4.5. GFP-transformatie
= micro-injectie op eiwitniveau, sequentie GFP naast gen plakken => mee afgeschreven
=> zichtbaar onder fluorescentiemicroscoop
4.6. RNA-interferentie
= maken van een knock-down individu geen knock-out
Dicer knipt RNA in stukjes, RISC bindt op het RNA
Deel degradeert ander deel met RISC bindt op overeenkomstig RNA RISC zorgt dat het
niet volledig afgeschreven wordt => geen volledig eiwit (+ slide 26)
, 5. Genetische screens
Forward: fenotype gekend => je zoekt genotype; vaak mutatie in gen aanbrengen en resultaat
bekijken
Reverse: genotype gekend => je zoekt fenotype
5.1. Chromosomale mutaties
Deletie: stuk weg
Duplicatie: stuk verdubbeld
Inversie: omgedraaid
Insertie: extra stuk ingebracht
Translocatie: verwisselt van plaats
5.2. DNA-mutaties
Substitutie: vervangen door ander
Deletie: verwijdert
Insertie: extra ingevoegd
Inversie: omgedraaid
Gevolgen:
Silent: geen invloed
Nonsense: vervroegd stopcodon
Missense: geconserveerd = ander aminozuur maar met dezelfde fysische eigenschappen
of niet geconserveerd = ander aminozuur met andere fysische eigenschappen
Hierbij kan je loss of function of gain of function hebben afh van de mutatie
Simple screens: genen met mutatie veroorzaken zelfde fenotype
Modifier screens: genen met mutatie die geen fenotype uitlokken, maar een regelende
rol spelen in het gennetwerk
5.3. Genetische interactie
2 loss of function allelen (slide 34)
- Negatieve interactie: beide allelen LOF = geen groei
- Positieve interactie: beide allelen LOF = groei
Tussen loss of function en overexpressie gen (slide 35)
- Synthetische dosis dood: geen groei
- Dosis suppresie: cel groei
5.4. Toediening mutagen
Bij L4 stadium: maximumaantal germline nuclei
Vroeger: kans op dubbel werk want mutaties kunnen herhaald worden
Later: minder efficiënt, eitjes impermeabel
5.5. Hoeveelheid individuen onderzocht
Gain of function = 100-200 petriplaten want 1/37500 gen kopies
Loss of function = 10-20 petriplaten want 1/2000 gen kopies
6. Soorten screens
6.1. Visual phenotype screening
= kijken naar een visueel verschil tussen individuen bv. Lengte of manier van bewegen
6.2. Selection screening
Omgeving creëren waar enkel de mutanten kunnen overleven (bv. Toxische omgeving)
=> je werkt alleen met de mutanten verder
6.3. Fluorescence based screens
Deel 1: Historiek, definite, criteria en mendaliaanse overerving
1. Historiek
Vroeger: observatie en beschrijving van dierenrijk
19de eeuw: embryologie
20ste eeuwn: splitsing embryologie en evolutionaire biologie
1.1. Experimentele embryologie
- Invloed beschadiging cellen in toekomst
- Cellen kleuren en volgen
- Manipuleren door transplantatie (bv. Groep die hoofd vormt ergens anders = 2
hoofden)
2. Definitie en keuze modelorganismen
Afh van wat je wil bestuderen, 6 meest gebruikte (besproken in cursus) => liggen niet verspreid
in dierenrijk
3. Criteria
Beschikbaarheid: zebravis en xenopus makkelijk in grote hoeveelheid te bekijken
Kostprijs: fruitvliegen in doosje goedkoper dan kooien van muizen
Toegankelijkheid: embryologisch onderzoek liefst buiten lichaam => kan niet altijd
Kleine lichaamsgrootte: soms materiaal te klein om mee te kunnen werken
Snelheid: bij een muis moet je veel langer wachten op een nieuwe generatie dan een fruitvlieg
Manipuleerbaarheid: hoe makkelik kan je het manipuleren buiten het lichaam
Genetica en genenkaarten:
Relevantie: muis staat dichter bij de mens dan de andere
Deel 2: Caenorhabditis elegans
= kennis uitbreiden naar meercellige organismen
1. Eigenschappen
- Klein, wijd verspreidt
- Makkelijk kweken op agarplaten
- Snelle generatietijd: 3 dagen
- Zelfbevruchtend hermafrodiet
- Vast en klein aantal cellen, wel alle germlayers, spijsverteringsstelsel, zenuwstelsel,
zintuigen, spieren, geslachtsstelsel, excretiestelsel
2. Ontwikkeling
Eerste delin => eerste larve => worm, 10% cellen deelt verder => groeit en vervelt 4 keer =>
volwassen
Ongunstige omstandigheden = slaapstadie tot betere omstandigheden
Brenner: maakte stamboom van alle cellen en hun uiteindelijke plaats, nadien volledig
delingspatroon opgesteld
2.1. Embryonale ontwikkeling
= invariant, elke cel deelt op hetzelfde moment in alle wormen samen
P0, P1, P2, P3 en P4 = germinale lijn
Mozaïekontwikkeling: alle cellen weten autonoom wat ze moeten doen en waar ze
naartoe moeten, bepaald door asymmetrische verdeling stoffen => hebben cellen
ernaast nodig om elkaar te helpen met communicatie
,3. Genoom
XX: hermafrodiet
XO: mannetje
5 chromosomen + 1 geslachtschromosoom
=> doen aan zelfbevruchting, dus minder generaties nodig om homozygote mutatie te
verkrijgen => voordeel
3.1. Kruising
Mannetjes belangrijk want homozygoten vaak lethaal en steriel dus:
- Mannetjes bewaren die heterozygoot zijn
- Mannelijk sperma voorrang bij terugkruising
- Nodig om mutatie te induceren in hermafrodiete individuen (slide 16)
3.2. Voordelen
- Snelle ontwikkeling
- Zelfbevruchting
- Genetische variatie en stocks dmv mannetjes
- Onuitputbare stock
- Manipulatie makkelijk
- Volledig genoom in kaart
4. Technieken
4.1. 4D-microscopie
Computermicroscoop = maakt 3D film van embryonale ontwikkeling
=> de celdeling kan autonoom gevolgd worden
=> opstelling delingspatroon
4.2. Laserablatie
= uitschakelen embryonale cellen met UV om signalen tussen cellen op te sporen
Laser = beschadiging van DNA = apoptose, maar hersteld soms
=> gat maken en cel eruit halen is beter
4.3. Micro-injectie
= inspuiten stof (bv. GFP en fluorescentie checken)
DNA-construct in ovaria (alle cellen zijn hier verbonden) inspuiten = nakomelingen
dragen mutant/vreemd gen
4.4. Transformatie met merkergen
= kijken welke nakomeling het ‘foute’ gen van de ouder heeft, door een merkergen naast
het foute gen te implementeren
4.5. GFP-transformatie
= micro-injectie op eiwitniveau, sequentie GFP naast gen plakken => mee afgeschreven
=> zichtbaar onder fluorescentiemicroscoop
4.6. RNA-interferentie
= maken van een knock-down individu geen knock-out
Dicer knipt RNA in stukjes, RISC bindt op het RNA
Deel degradeert ander deel met RISC bindt op overeenkomstig RNA RISC zorgt dat het
niet volledig afgeschreven wordt => geen volledig eiwit (+ slide 26)
, 5. Genetische screens
Forward: fenotype gekend => je zoekt genotype; vaak mutatie in gen aanbrengen en resultaat
bekijken
Reverse: genotype gekend => je zoekt fenotype
5.1. Chromosomale mutaties
Deletie: stuk weg
Duplicatie: stuk verdubbeld
Inversie: omgedraaid
Insertie: extra stuk ingebracht
Translocatie: verwisselt van plaats
5.2. DNA-mutaties
Substitutie: vervangen door ander
Deletie: verwijdert
Insertie: extra ingevoegd
Inversie: omgedraaid
Gevolgen:
Silent: geen invloed
Nonsense: vervroegd stopcodon
Missense: geconserveerd = ander aminozuur maar met dezelfde fysische eigenschappen
of niet geconserveerd = ander aminozuur met andere fysische eigenschappen
Hierbij kan je loss of function of gain of function hebben afh van de mutatie
Simple screens: genen met mutatie veroorzaken zelfde fenotype
Modifier screens: genen met mutatie die geen fenotype uitlokken, maar een regelende
rol spelen in het gennetwerk
5.3. Genetische interactie
2 loss of function allelen (slide 34)
- Negatieve interactie: beide allelen LOF = geen groei
- Positieve interactie: beide allelen LOF = groei
Tussen loss of function en overexpressie gen (slide 35)
- Synthetische dosis dood: geen groei
- Dosis suppresie: cel groei
5.4. Toediening mutagen
Bij L4 stadium: maximumaantal germline nuclei
Vroeger: kans op dubbel werk want mutaties kunnen herhaald worden
Later: minder efficiënt, eitjes impermeabel
5.5. Hoeveelheid individuen onderzocht
Gain of function = 100-200 petriplaten want 1/37500 gen kopies
Loss of function = 10-20 petriplaten want 1/2000 gen kopies
6. Soorten screens
6.1. Visual phenotype screening
= kijken naar een visueel verschil tussen individuen bv. Lengte of manier van bewegen
6.2. Selection screening
Omgeving creëren waar enkel de mutanten kunnen overleven (bv. Toxische omgeving)
=> je werkt alleen met de mutanten verder
6.3. Fluorescence based screens
