Geavanceerde chemische analyse, beeldvorming- en verwerking
Microscopie inleiding
1. Microscopen
Resolutie = het vermogen om 2 punten van elkaar te onderscheiden
1.1. Licht- of klaarveldmicrosccop (LM)
= objectief lens: 1 tot 100 x
= oculair lens: 5 tot 10 x (beide 10x = een vergroting van 100x)
NA = numerieke apertuur: openingshoek lichtkegel (alfa) X brekingsindex (N) =>
bepaald hoe goed en hoe duur de lens is
Soms extra uitgang op de microscoop voor bv. Een camera op te zetten en foto’s van te
kunnen maken
OlyVIA = een systeem waarbij een materiaal ingescand wordt en later op computers
bekeken kan worden
Darmweefsel: gekleurd met PAS voor de vrije suikers, hematoxyline voor zure
componenten en eosine voor acidofiele stoffen
Principe
Golflengtes over volledige plaat uitgezonden, kleur van weefsel past golflengte aan =>
visueel zichtbaar
Als de coupes niet gekleurd zijn = organellen passen de golflengten aan
Klein weefsel = op dekglaasje
Groot weefsel = in parrafine en in schijfjes snijden
Levende cellen: best met fasecontrastmicroscoop
1.2. Fluorescentiemicroscoop
Vaak met epi-illuminatiesysteem, gefilterde excitatielicht via dichromatische
beamsplitter naar achterste opening objectief gereflecteerd
Fluorochroom: je weet de excitatiegolflengte en emissiegolflengte, afh daarvan excitatie
en barrièrefilters gebruiken (slide 18 en 19)
Excitatiefilter: bepaald welk licht op het materiaal gezonden wordt
Barrièrefilter: bepaald welk licht er in het oog komt
Soorten
Ion-gevoelige kleurstoffen: fluorescentie gebruikte kleurstof hangt af van conc ionen
Immunofluorescentie microscopie: eiwitten detecteren met antilichamen
Tagging: taggen met fluorescente eiwitten
Fusie-eiwitten: een fluorescente sequentie invoeren in het leesraam => zichtbaar in de
ontwikkeling
Nadeel
Fluorochromen verliezen snel fluorescentie => nanopartikels, vanaf activatie blijven ze
fluorescentie behouden
Fluorochroom = fluorofoor (voor fluorescentie) + chromofoor (kleur)
1.3. Confocaal laserscanning microscoop (CLSM)
Confocaal = kleuren uit elkaar halen
Licht door pinhole 1 = optische aftasting van staal, pinhole 2 = zorgt dat emissielicht van
boven of onder focale vlak de detector niet bereikt en licht van het focale vlak de PMT-
detector wel bereikt
, Maakt het mogelijk om maar naar 1 vlak te kijken (+ slide 35)
1.4. Deconvolutie-fluorescentiemicroscoop
Berekening adhv een computer om cel in beeld te brengen => scherper beeld maar
slechter dan CLSM (CLSM is duurder)
1.5. 4D live cell imaging
= levend materiaal in de tijd volgen; met timelapse
XY-richting: over plaat bewegen
Z-richting: kijken op verschillende hoogtes
Verschillende golflengtes: verschillende kleuren
Opnames in tijd
1.6. 3D fluorescentie
Als je een bol hebt weet je niet wat er aan de binnenkant zit => je gaat laag per laag af
1.7. Elektronenmicroscoop (EM)
Soorten:
TEM: transmissie-elektronenmicroscoop = elektronenverstrooiing op zware atoomkernen
in ultradun preparaat
SEM: scanning-elektronenmicroscoop = preparaat groot en dik, gecoat met zwaar
metaal, afgescand met elektronenbundel (+ slide 46)
Negatieve kleuring = bestuiving met verdampt metaal waarbij alles errond gekleurd
wordt en waar de organellen aanwezig zijn geen kleuring is (=> wit waar een element
aanwezig was)
(zie slides 51-57 voor voorbeelden)
Speciale EM technieken
Vries-breek: info over membraanstructuren, we breken de membranen open =>
contouren makkelijk zichtbaar door er zware metalen op in te laten werken=> beeld van
de groeven
Vries-ets: grotere diepte via sublimatie
Cryo-electronen-tomografie: 3D reconstructie van object op basis van 2D projecties
Fixatie en kleuring materiaal
+ zie slides voor afbeeldingen
1. Fixatie, stap 1
= plots doden van weefsel maar oorspronkelijke structuur behouden
= permeabiliseren membraan
= harder en poreuzer maken weefsel
Soorten:
Chemische fixatie: immersie of perfusie van weefsel met fixatief vernettende fixatieven
(Formaldehyde, glutaraldehyde, OsO4) of precipiterende fixatieven (alcohol, aceton,..)
Fysische fixatie: bevriezen
1.1. Formaldehyde
= formol, een gas
Bevat methanol om polymerisatie tegen te gaan, reageert met meerdere delen van
eiwitten
= gemaakt in PBS
= niet te ver op voorhand maken want anders worden er polymeren gevormd
1.2. Glutaraldehyde
Wordt op deze manier aangekocht
= reactie met aminogroepen eiwitten, kan aan meerdere eiwitten binden
= minder goed voor immunocytochemie
1.3. Osmiumtetroxide (OsO4)
= oxiderende stof en cross-linker
Bindt met lipiden, minder vaak gebruikt want moet in aparte ruimte
Lm: formol, PAF en glutaraldehyde
EM: glutaraldehyde en OsO4
, Factoren die fixatie beïnvloeden:
- Buffers en H-ionen conc
- Temperatuur
- Volumeverandering
- Snelheid penetratie
- Conc ficatief
- Duur fixatie
Perfussie: grotere weefsels zoals hersenen fixeren door rechtstreeks via bloedbaan fixatief in
te brengen
(un)masking epitope: cross-linking met formaldehyde = antilichaam kan niet meer binden op
epitoop => stuk verwijderen = kan wel binden
2. Inbedden, stap 2
= gefixeerde materiaal doordrengen met inbedmiddel, substantie die hard wordt en snijdbaar is
(paraffine, hars of plastic)
Eerst moet weefsel ontwatert worden = stijging alcoholpercentage tot 100%
Clearing: wordt in tolueen gedaan
2.1. Alternatieve inbedmiddelen
Harsen met hydrofiele structuren: LR white, LR gold en OsO4 (negatieve invloed op
polymerisatie)
Hydrofiele inbedmiddelen: glycol metacrylaat
Soms ook vriescoupes
3. Snijden
LM: 2 micrometer coupes
EM: 70 nanometer coupes
Hoe dunner => glas of diamantmes
3.1. Vriescoupes
= als je snel resultaat wilt, oplosbare bestanddelen of enzymactiviteit aantonen
Fixatie bij hoge druk: snel invriezen bij hoge druk = verhinderen van ijskristallen
Vriessubstitutie: met agentia bij temperaturen onder 0
Cationisch: positief geladen
Anionisch: negatief geladen
4. Kleuren
Hematoxyline + aluminiumzouten = kationisch => basische kleurstof, reageert met basofiele
bestanddelen (nucleïnezuren celkern)
Eosine = anionisch => zure kluerstof, reageert met acidofiele componenten (eiwitten
cytoplasma)
=> kan met de hand of automatisch gekleurd worden
Trichoom: bindweefselkleuring => kernen = blauw, cytoplasma = rood en collageen =
groen/blauw
Zilverkleuring => reticuline = zwart en vezels = licht bruin
Orceine => affiniteit desmosine en isodesmosine
Vetten kleuren
= vriescoupes met indifferente kleurstoffen kleuren (oil red O of sudan black)
5. Elektronenmicroscopie
Dense structuren = absorberen elektronen
Minder dense structuren = laten elektronen door
Soms moet je densiteitverschillen verhogen => contrasteren, doe je met zware metalen:
OsO4: reeds bij fixatief, als 2de fixatief = contrast
Microscopie inleiding
1. Microscopen
Resolutie = het vermogen om 2 punten van elkaar te onderscheiden
1.1. Licht- of klaarveldmicrosccop (LM)
= objectief lens: 1 tot 100 x
= oculair lens: 5 tot 10 x (beide 10x = een vergroting van 100x)
NA = numerieke apertuur: openingshoek lichtkegel (alfa) X brekingsindex (N) =>
bepaald hoe goed en hoe duur de lens is
Soms extra uitgang op de microscoop voor bv. Een camera op te zetten en foto’s van te
kunnen maken
OlyVIA = een systeem waarbij een materiaal ingescand wordt en later op computers
bekeken kan worden
Darmweefsel: gekleurd met PAS voor de vrije suikers, hematoxyline voor zure
componenten en eosine voor acidofiele stoffen
Principe
Golflengtes over volledige plaat uitgezonden, kleur van weefsel past golflengte aan =>
visueel zichtbaar
Als de coupes niet gekleurd zijn = organellen passen de golflengten aan
Klein weefsel = op dekglaasje
Groot weefsel = in parrafine en in schijfjes snijden
Levende cellen: best met fasecontrastmicroscoop
1.2. Fluorescentiemicroscoop
Vaak met epi-illuminatiesysteem, gefilterde excitatielicht via dichromatische
beamsplitter naar achterste opening objectief gereflecteerd
Fluorochroom: je weet de excitatiegolflengte en emissiegolflengte, afh daarvan excitatie
en barrièrefilters gebruiken (slide 18 en 19)
Excitatiefilter: bepaald welk licht op het materiaal gezonden wordt
Barrièrefilter: bepaald welk licht er in het oog komt
Soorten
Ion-gevoelige kleurstoffen: fluorescentie gebruikte kleurstof hangt af van conc ionen
Immunofluorescentie microscopie: eiwitten detecteren met antilichamen
Tagging: taggen met fluorescente eiwitten
Fusie-eiwitten: een fluorescente sequentie invoeren in het leesraam => zichtbaar in de
ontwikkeling
Nadeel
Fluorochromen verliezen snel fluorescentie => nanopartikels, vanaf activatie blijven ze
fluorescentie behouden
Fluorochroom = fluorofoor (voor fluorescentie) + chromofoor (kleur)
1.3. Confocaal laserscanning microscoop (CLSM)
Confocaal = kleuren uit elkaar halen
Licht door pinhole 1 = optische aftasting van staal, pinhole 2 = zorgt dat emissielicht van
boven of onder focale vlak de detector niet bereikt en licht van het focale vlak de PMT-
detector wel bereikt
, Maakt het mogelijk om maar naar 1 vlak te kijken (+ slide 35)
1.4. Deconvolutie-fluorescentiemicroscoop
Berekening adhv een computer om cel in beeld te brengen => scherper beeld maar
slechter dan CLSM (CLSM is duurder)
1.5. 4D live cell imaging
= levend materiaal in de tijd volgen; met timelapse
XY-richting: over plaat bewegen
Z-richting: kijken op verschillende hoogtes
Verschillende golflengtes: verschillende kleuren
Opnames in tijd
1.6. 3D fluorescentie
Als je een bol hebt weet je niet wat er aan de binnenkant zit => je gaat laag per laag af
1.7. Elektronenmicroscoop (EM)
Soorten:
TEM: transmissie-elektronenmicroscoop = elektronenverstrooiing op zware atoomkernen
in ultradun preparaat
SEM: scanning-elektronenmicroscoop = preparaat groot en dik, gecoat met zwaar
metaal, afgescand met elektronenbundel (+ slide 46)
Negatieve kleuring = bestuiving met verdampt metaal waarbij alles errond gekleurd
wordt en waar de organellen aanwezig zijn geen kleuring is (=> wit waar een element
aanwezig was)
(zie slides 51-57 voor voorbeelden)
Speciale EM technieken
Vries-breek: info over membraanstructuren, we breken de membranen open =>
contouren makkelijk zichtbaar door er zware metalen op in te laten werken=> beeld van
de groeven
Vries-ets: grotere diepte via sublimatie
Cryo-electronen-tomografie: 3D reconstructie van object op basis van 2D projecties
Fixatie en kleuring materiaal
+ zie slides voor afbeeldingen
1. Fixatie, stap 1
= plots doden van weefsel maar oorspronkelijke structuur behouden
= permeabiliseren membraan
= harder en poreuzer maken weefsel
Soorten:
Chemische fixatie: immersie of perfusie van weefsel met fixatief vernettende fixatieven
(Formaldehyde, glutaraldehyde, OsO4) of precipiterende fixatieven (alcohol, aceton,..)
Fysische fixatie: bevriezen
1.1. Formaldehyde
= formol, een gas
Bevat methanol om polymerisatie tegen te gaan, reageert met meerdere delen van
eiwitten
= gemaakt in PBS
= niet te ver op voorhand maken want anders worden er polymeren gevormd
1.2. Glutaraldehyde
Wordt op deze manier aangekocht
= reactie met aminogroepen eiwitten, kan aan meerdere eiwitten binden
= minder goed voor immunocytochemie
1.3. Osmiumtetroxide (OsO4)
= oxiderende stof en cross-linker
Bindt met lipiden, minder vaak gebruikt want moet in aparte ruimte
Lm: formol, PAF en glutaraldehyde
EM: glutaraldehyde en OsO4
, Factoren die fixatie beïnvloeden:
- Buffers en H-ionen conc
- Temperatuur
- Volumeverandering
- Snelheid penetratie
- Conc ficatief
- Duur fixatie
Perfussie: grotere weefsels zoals hersenen fixeren door rechtstreeks via bloedbaan fixatief in
te brengen
(un)masking epitope: cross-linking met formaldehyde = antilichaam kan niet meer binden op
epitoop => stuk verwijderen = kan wel binden
2. Inbedden, stap 2
= gefixeerde materiaal doordrengen met inbedmiddel, substantie die hard wordt en snijdbaar is
(paraffine, hars of plastic)
Eerst moet weefsel ontwatert worden = stijging alcoholpercentage tot 100%
Clearing: wordt in tolueen gedaan
2.1. Alternatieve inbedmiddelen
Harsen met hydrofiele structuren: LR white, LR gold en OsO4 (negatieve invloed op
polymerisatie)
Hydrofiele inbedmiddelen: glycol metacrylaat
Soms ook vriescoupes
3. Snijden
LM: 2 micrometer coupes
EM: 70 nanometer coupes
Hoe dunner => glas of diamantmes
3.1. Vriescoupes
= als je snel resultaat wilt, oplosbare bestanddelen of enzymactiviteit aantonen
Fixatie bij hoge druk: snel invriezen bij hoge druk = verhinderen van ijskristallen
Vriessubstitutie: met agentia bij temperaturen onder 0
Cationisch: positief geladen
Anionisch: negatief geladen
4. Kleuren
Hematoxyline + aluminiumzouten = kationisch => basische kleurstof, reageert met basofiele
bestanddelen (nucleïnezuren celkern)
Eosine = anionisch => zure kluerstof, reageert met acidofiele componenten (eiwitten
cytoplasma)
=> kan met de hand of automatisch gekleurd worden
Trichoom: bindweefselkleuring => kernen = blauw, cytoplasma = rood en collageen =
groen/blauw
Zilverkleuring => reticuline = zwart en vezels = licht bruin
Orceine => affiniteit desmosine en isodesmosine
Vetten kleuren
= vriescoupes met indifferente kleurstoffen kleuren (oil red O of sudan black)
5. Elektronenmicroscopie
Dense structuren = absorberen elektronen
Minder dense structuren = laten elektronen door
Soms moet je densiteitverschillen verhogen => contrasteren, doe je met zware metalen:
OsO4: reeds bij fixatief, als 2de fixatief = contrast
