Genetica en Genomica – Hoofdstuk 16 – UHasselt – Academiejaar – Samenvatting over toepassingen van recombinant DNA-technologie en DNA-typering

H16: TOEPASSINGEN VAN RECOMBINANT DNA-TECHNOLOGIE

1. Analyse van DNA- polymorfismen
 DNA is polymorf, vele sequenties van individu tot individu
DNA-polymorfisme= plaats in genoom met 2 of meer allelische varianten, die elk relatief
frequent 1%) voorkomen in een populatie: deze laatste beperking sluit zeldzame mutaties in
DNA-moleculen uit, omdat deze niet bruikbaar zijn in genetische analyses
 meestal geen fenotypisch effect

DNA- merkers = polymorfismen waarvan men de exacte positie in het genoom kent, ze
kunnen worden gebruikt voor het opmaken van fysische en genetische kaarten
 gebruikt voor fysische en genetische kaarten

 GEBRUIK VAN DNA-POLYMORFISMEN IN GENETISCHE ANALYSE
 tot nu toe: genen als merkers voor genetische analyse
 genen hebben verschillende allelen die verschillende fenotypes produceren die in
kruisingen gevolgd kunnen worden
 bv. om een beeld te vormen vande rangschikking van genen in het genoom —> een
genetische kaart, er worden kruisingen gemaakt tussen
 ouders die verschillen in allelen van 2 of meer genen en de fractie van recombinante
fenotypes onder het nageslacht wordt bepaald
 resultaten genetische mappingskruisingen
‣ locatie aangeven op het chromosoom = de locus (voor elk gen dat in kaart is
gebracht)

 KLASSEN van DNA-POLYMORFISMEN
 SNP’s: Single nucleotide polymorfismen
 STR’s Short Tandem Repeats = microsatellieten
 VNTRs: Variable number of tandem repeats = minisatellieten

 SNP’s
 kunnen worden gebruikt voor genomische karakterisering & mapping
 Twee varianten (allelen): base substitutie




 SNPs die knipplaats veroorzaken: Restriction Fragment Length Polymorfism  (RFLP)
 een klein deel van de SNP’s is van invloed op restrictiesites door ze te creëren of
te elimineren, derfelijke SNP’s kunnen worden gedetecteerd m.b.v. restrictie-enzym
voor de plaats en ofwel Southern blot-analyse of, meer typisch tegenwoordig, door
PCR
—> de verschillende patronen van restrictieplaatsen in verschillende genomen
resulteren in restrictiefragmentlengtepolymorfismen (= RFLP’s)
 Meeste veranderingen (SNP’s) echter niet in knipplaats: detectie via SNP-chip




 RFLP

,  zijn door restrictie-enzymen gegenereerde fragmenten van verschillende lengtes




 aan de hand van het bandenpatroon kan je het genotype van een individu afleiden

 Analyse RFLP
 Southern blotting
 PCR (sneller, maar wordt niet meer gebruikt)

 RFLP: detectie




 SNPs met verandering in knipplaats: Southern blot
fig: theoretisch segment van 7kb in genoom met paar SNP-allelen
Een stuk van 7 kb van het chromosoom heeft Ban-sites aan elk
uiteinde. SNP-allel 1 (boven) heeft een Bambl-site 2b vanaf
het linkeruiteinde, terwijl SNP-allel 2 (onder) een C-C-basenpaar
heeft in plaats van een 7-A-basenpaar, zodat de Bamll-site
verloren is gegaan. Basilicum-digestie met DNA-monsters van
individuen met verschillende SNP-genotypes, gevolgd door
Southern Not-analyse met behulp van de getoonde sonde,
geeft de DNA- bandpatronen aan de onderkant




 SNPs verandering in knipplaats: PCR
fig: Een deel v/h chromosoom van 2000 bp heeft SNP-allelen
op 500 bp van het linkeruiteinde. De verandering van TA naar
CG van SNP allel 1 (boven) naar SNP allel 2 le 2 (onder) verandert
een Bantil-plaats in een sequentie die niet wordt herkend door
een restrictie-enzym. PCR van DNA-monsters van individuen met
verschillende SNP-allelgenotypes met behulp van de getoonde linker
en rechter primers, gevolgd door Bamt-digestie, geeft het
DNA-bandpatroon onderaan