Genetica en Genomica – Hoofdstuk 6 – UHasselt – Academiejaar – Samenvatting recombinant DNA-technologie en genoomanalyse

ZSO 6: Recombinant DNA-technologie en genoomanalyse I
Genomica = verkrijgen van genetische info + vervolgens analyseren

1. het omzetten van genomen in klonen, en klonen in genomen
 genomen: te groot om zo te bestuderen (3 milj basenparen)
--> moeten in kleinere stukken gemaakt worden
 we maken een restriction map van een genoom
= kaart van de chromosomen met de plaatsen van genen, promotors,
DNA basenparen….
 kloonvector= een kunstmatig geconstrueerde DNA-molecule die in staat is te
repliceren in een gastheerorganisme zoals een bacterie

 DNA KLONEN
Stappen:
1. Isoleer DNA van een organisme
2. - knip het DNA in stukken met een restrictie-enzym
- en voeg elk stuk individueel in een kloonvector met hetzelfde restrictie-
enzym om een recombinant DNA-molecuul te maken
- in vitro DNA molecule = opgebouwd uit sequenties van 2 of meer
verschillende DNA moleculen
3. Introduceer recombinante DNA-moleculen in gastheercel
Replicatie van recombinante DNA-molecule
 als gastheercel reproduceert  recombinante DNA --> alle nakomelingen

o Restrictie enzym= enzym dat specifiek DNA sequentie herkent en doorsnijdt
 splitst DNA in
- Blunt ends= symmetrische sequentie wordt in het midden gesplitst
- 5’ sticky ends= overhang bij de 5’ kant
- 3’ sticky ends= overhang bij de 3’ kant
 voordeel: verschillende DNA strengen die gekloond werden
in even grote stukken geknipt
 soms wordt er aan ‘partial digest’ gedaan  niet alles wordt
geknipt  stukken van verschillende lengte

o Algemene eigenschappen:
o
 functie:
- groep DNA-fragmenten produceren die gekloond knn worden
- positie restrictieplaatsen in stuk gekloond DNA of in
DNA-segment in genoom analyseren
 voordeel: verschillende DNA-strengen die gekloond
worden in verschillende even grote stukken geknipt
o frequentie van voorkomen van restrictieplaatsen in DNA
 frequentie van kort basenpaar zal groter zijn dan frequentie lang basenpaar
 BV. enzym dat 4-nucleotide paar sequentie herkent zal een DNA molecule
veel frequenter knippen dan een 6-nucleotide paar sequentie

, Voorbeeld:
DNA met 50% GC  AT zal ook 50% voorkomen
 alle 4 nucleotiden evenveel kans
HpaII: 5’ GGCC 3’ 1e paar: G kans = 1/4 3e paar: C kans = 1/4
3’ CCGG 5’ C G
2e paar: G kans = 1/4 4e paar: C kans = 1/4
C G
Kans HpaII: ¼ . ¼ . ¼ . ¼ = 1/256 G
 HpaII komt elke 265 basenparen voor
G
o restrictieplaatsen en creeëren van recombinante DNA moleculen
 sommige restrictie enzymen (Sma I) binden beide strengen op zelfde
plaats
 sommigen (BamH I) knippen symmetrisch  sticky ends ontstaan
(5’ overhand ends)
 sommige (Pst I) knippen symmetrisch  sticky ends ontstaan
(3’ overhand ends)
 gebruikt in kloning omdat ze dezelfde sequentie hebben op de
overhanding ends




 KLOONVECTORS EN DNA KLONEN
 om sequentie van genoom te bepalen
--> genoom in fragmenten breken en elk fragment klonen om meerdere
kopieën te produceren

o Plasmide klonen vectoren
 Plasmide DNA = dubbelstrengig en circulair
--> bevat een origin sequence --> nodig voor replicatie van plasmide

 E. coli plasmide klonen vector moet 3 kenmerken bevatten
1) een ‘origin of DNA replication’ (ori) sequentie
2) een ‘selectable marker’ = vaak antibiotica
= een gen waarmee we knn bepalen of een cel de
kloonvector wel of niet bevat
3) een unieke restrictie-enzymen knop plaatsen
 dient om stukje DNA in en vector te kunnen brengen



Fig: plasmid cloning vector pBLuescript II