Samenvatting H3: hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC)

H3: hoge prestatie
vloeistofchromatografie (HPLC)
Inleiding

 In de jaren 70 bleek klassieke vloeistofkolomchromatografie (LSC en
LLC) weinig efficiënt vergeleken met gaschromatografie
o Lange elutietijden onder hydrostatische druk leiden tot diffusie
en vervaging van zones
 Kleinere korreldiameter van de stationaire fase verbetert scheiding,
maar verlengt analysetijd bij dezelfde kolomlengte en druk
o Rond 1970 kon de korrelgrootte worden verkleind van 150 µm
naar 10 µm, wat snelle analyses mogelijk maakt mits hogere
ingangsdruk van de mobiele fase
o Dit leidde tot HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
met drukken van 50–300 bar
 HPLC is snel groeiend, heeft een belangrijke plaats naast
gaschromatografie, en wordt gebruikt voor research en
routineanalyses
o Sinds 2004 bestaat UPLC (Ultra High Performance Liquid
Chromatography) met kolldetails van 1,8 µm en drukken
>1000 bar.
 Redenen voor HPLC’s populariteit:
o Scheidingen die vroeger uren duurden, nu in minuten mogelijk
o Zeer gevoelig methode
o Geschikt voor accurate kwantitatieve bepalingen
o Veel goede detectoren beschikbaar
o Kan niet-vluchtige en thermolabiele stoffen scheiden en
kwantificeren
 Voorbeelden van stoffen die HPLC kan analyseren: aminozuren,
proteïnen, nucleïnezuren, hormonen, suikers, steroïden, drugs,
pesticiden, antibiotica…

Apparatuur




Pomp:

,  Voor snelle en efficiënte HPLC-scheidingen moet de pomp:
o Een regelbare en constante stroming van de mobiele fase
leveren
o Pulsvrij werken om storing van detectoren (bv. UV-detector) te
vermijden
 Drukpulsen veroorzaken een zigzag in de basislijn, waardoor kleine
signalen moeilijk meetbaar zijn en de gevoeligheid afneemt.
 Alternatieve plunjerpomp:
o Zuiger beweegt voor- en achterwaarts in een kleine kamer
o Klepsysteem zorgt voor beurtelings opzuigen en naar kolom
sturen van vloeistof
 Probleem: een enkele kamer levert pulsen → oplossing: dubbele
kamer, zodat de ene kamer vult terwijl de andere pompt
 Opmerking: bij hoge druk kan gas oplossen in de vloeistof →
ontgassen van oplosmiddelen is noodzakelijk om problemen in de
detector te voorkomen

Het injectiesysteem

Het injectiesysteem zorgt ervoor dat een opgeloste monster in de
vloeistofstroom wordt gebracht zonder de stroom te onderbreken en
zonder verdunning van het staal, zodat de reproduceerbaarheid,
gevoeligheid en scheidingskwaliteit behouden blijven

(a) Septuminjector
 Eenvoudigste type injector
 Injectie met een spuit via een rubberen septum direct boven de
kolomvulling
 De vloeistofstroom blijft lopen
 Alleen bruikbaar bij lage druk
(b) Stop-flow injector
 Vergelijkbaar met de septuminjector, maar de vloeistofstroom wordt
tijdelijk gestopt tijdens de injectie
 De injectiepoort wordt geopend, het staal ingebracht, daarna
gesloten en de stroom hersteld
 Geschikt voor hogere drukken
(c) Lus- of loopinjector
 Een buisje met vast volume (lus) wordt eerst gevuld met het staal
 Vervolgens wordt de solventstroom omgeschakeld zodat het staal
naar de kolom wordt gevoerd
 Het geïnjecteerde volume hangt af van de lengte en diameter van
de lus
 Voor een ander volume moet de lus worden vervangen
 Geeft iets meer piekverbreding, maar biedt hoge
reproduceerbaarheid

, Isocratische elutie vs gradiëntelutie

Isocratische elutie
 De loopfase (mobiele fase) blijft de hele analyse hetzelfde
 Geschikt voor eenvoudige mengsels met vergelijkbare componenten
 Eenvoudig systeem, maar minder efficiënt bij componenten met
sterk verschillende polariteit.
Gradiëntelutie
 De samenstelling van de loopfase verandert tijdens de analyse
 Wordt gebruikt voor complexe mengsels met grote verschillen in
polariteit
 Door de oplosmiddelsterkte geleidelijk te verhogen, elueren sterk
gebonden componenten sneller → betere scheiding in kortere tijd
 Twee uitvoeringen:
o Hoge-drukgradiëntsysteem: meerdere solventen, meerdere
pompen en een mengkamer op hoge druk
o Lage-drukgradiëntsysteem: meerdere solventen, een
proportioneringsklep en één pomp

Kolommen en kolomvullingen (algemeen)

Kolommen
 In vloeistofchromatografie worden altijd gepakte kolommen gebruikt
 Glazen kolommen zijn ongeschikt bij hoge drukken → roestvrijstalen
kolommen geven de beste resultaten (gladde binnenwand,
constante diameter).
 Diameter: in analytische HPLC meestal 3–5 mm.
 Vorm: meestal recht, voor eenvoudig vullen.

Kolomvullingen (stationaire fase)
 Bestaat uit korrelmateriaal met hoge porositeit → groot specifiek
oppervlak
 Vroegere pakkingen:
o Grote deeltjes (> 40 µm), zeer poreus
o Voordeel: groot staalvolume
o Nadeel: grote verschillen in diffusietijden (in en uit poriën) →
minder efficiënt en piekverbreding

Verbeteringen
1. Porous Layer Beads (PLB)
o Glaspartikels met dunne poreuze laag stationaire fase.
o Voordelen: hogere efficiëntie, hogere lineaire snelheden
mogelijk.
o Nadelen: duur en lage capaciteit (klein specifiek oppervlak
t.o.v. diameter).
2. Micropartikels (5–10 µm, sinds 1970)