H1: MICROSCOPY BASICS
1.1 INTRODUCTIE
Het menselijke oog is aanpasbaar aan verschillende omstandigheden, maar wel beperkt in mogelijkheden. We
zien een variabele focus van de lens met een geïnverteerde afbeelding. De iris is een circulair diafragma en
dient als afscherming om de cornea te beschermen. De retina is een scherm met een enorm bereik en hoge
resolutie (resolving power) door neuronen en fotoreceptoren. Deze laatste kunnen we onderverdelen in
staafjes en kegeltjes met verschillende gevoeligheden. Wel is het oog beperkt in vermogen en vergroting. Ons
maximaal onderscheidend vermogen is beperkt, namelijk tot 0,1 mm.
Een lens vergroot. Dit is makkelijker voor het oog om het onderscheid te maken. Lenzen bestaan al heel lang.
Met 2 lenzen kunnen we nog meer vergroten en een grotere afstand creëren waardoor we objecten nog beter
kunnen bekijken. De eerste microscoop is een omgekeerde telescoop. Er is een lens om te vergroten en dan
een lens om het te projecteren op het netvlies.
1.2 GOLFEIGENSCHAPPEN VAN LICHT
1.2.1 SPECTRUM
Het zichtbare licht is slechts een mini fractie van het EM spectrum. Het heeft een bereik tussen 400 en 700 nm:
van het UV-achtige blauw (400 nm) tot het groen (500 nm) naar het rode licht (700 nm).
1.2.2 REFRACTIE
Licht heeft een bepaalde snelheid in vacuüm. In een andere middenstof gaat die snelheid vertragen. Dit
concept heet refractie. Elk medium dat vertraagt heeft een bepaalde brekingsindex (n). Hoe hoger deze index,
hoe trager het licht zich hierin verplaatst.
Als licht niet recht zou invallen, maar schuin, gaat het licht breken want het licht buigt af. Als het licht breekt
van ijl naar dicht (van lage n naar hoge n), breekt het naar de normaal toe. Van dicht naar ijl is van de normaal
weg.
1.2.3 DISPERSIE
Breking of refractie is voor wit licht maar elke golflengte reageert hier verschillend
op. Blauw gaat harder afbuigen dan rood licht. Daarom is de hemel ook blauw. Je
krijgt een uitspreiding omgekeerd evenredig met de golflengte. Dit heet dispersie.
, Onder een bepaalde hoek zien we totale reflectie. Hier is de
invallende hoek even groot als de terugkaatsende hoek. Deze
hoek is de kritische hoek.
1.2.4 DIFFRACTIE
Een golf begint uit te buigen wanneer het een kleine opening passeert.
De grootte van de opening wordt bepaald door de golflengte.
Diffractie vindt enkel plaats wanneer de opening kleiner is dan de
golflengte. Na de opening zien we een sferische golf.
Het oplossend vermogen is het vermogen van het optische instrument om
afzonderlijke beelden te produceren van 2 aangrenzende punten.
Het licht dat eruit komt gaat niet meer in een vlotte beweging bewegen.
We krijgen licht dat later aankomt en gaat met zichzelf beginnen
interfereren. Twee van dergelijke diffractiepatronen beginnen met
elkaar te interfereren: sterker effect als ze tegelijk zijn (constructieve
interferentie), minder sterk effect als ze niet perfect simultaan liggen
(destructieve interferentie). Bij constructieve interferentie wordt de
amplitude 2x zo groot. Bij destructieve interferentie is er een halve golflengte verschil. Hierdoor zal het
minimum samenvallen met het maximum waardoor de golven elkaar uitdoven.
1.3 LENS THEORIE
Een perfecte convexe lens heeft een focaal punt, het punt waarop het licht wordt gefocusseerd.
1.3.1 REGELS LENSTHEORIE
1. Parallelle stralen convergeren naar een focaal punt.
2. Licht dat uit het focaal punt komt, gaat perfect parallel uitschijnen.
3. Stralen die door het centrum gaan, worden niet afgebogen.
,1.3.2 CONVEXE LENS VERGROTING
Adhv 3 lijnen kijken we waar het object zich bevindt.
- Parallelle lijn met optische as die afbuigt door het focaal punt
- 2e lijn die door het focaal punt gaat
- 3e lijn door het midden van de lens, ongehinderd
Obv hiervan kan je tekenen en visualiseren waar het object zich bevindt
Focale afstand (f): tussen het centrum van de lens en focaal punt.
Di: afstand tot object
SITUATIE 1: VOORWERPSAFSTAND IS GROTER DAN 2F
1 1 1
+ = => di = 3/2f M = -1/2 (neg want omgekeerd)
3𝑓 𝑑𝑖 𝑓
Het beeld is verkleind, reëel, geïnverteerd en het staat verder. Een voorbeeld hiervan is een foto van een
landschap.
SITUATIE 2: VOORWERPSAFSTAND IS GELIJK AAN 2F
1/di = 1/2f => di = 2f M = -1
Het beeld is even groot, reëel, geïnverteerd en het staat even ver. Een voorbeeld hiervan is een portretfoto.
SITUATIE 3: VOORWERPSAFSTAND LIGT TUSSEN F EN 2F
Di = 3f M = -2
Het beeld is groter, reëel, geïnverteerd en het staat verder.
SITUATIE 4: VOORWERPSAF STAND IS GELIJK AAN F
Di = 0 M = oneindig
We krijgen geen beeld dus we krijgen een object op oneindig want de lijnen
gaan parallel. Dit is handig bij microscopen want we krijgen een oneindige
ruimte waar we kunnen spelen met lenzen. Met een tweede lens kan het beeld
gecapteerd worden.
SITUATIE 5: VOORWERPSAFSTAND IS KLEINER DA N F
Di = -f M = +2
Het beeld is groter, virtueel, rechtopstaand en het staat aan dezelfde kant als
het object. Dit zien we bij een loupe.
1.4 OPTISCHE TREIN VAN ONDERDELEN MICROSCOOP
Dit is een transmissie microscoop. Die bestaat uit:
Lichtbron – lens om te focusseren (condensor) –
vergroting: objectief – oculair gaat fungeren als
een extra vergroting om een virtueel beeld te
creëren naar het oog.
We zien dus een tweestapsproces: Mtot= Mobj * Moc
, Het objectief gaat het object vergroten. Het reële beeld ligt dichter bij de lens
dan de brandpuntafstand dus we gaan een virtueel beeld vormen na het oculair.
Dat wordt uiteindelijk toch een reëel beeld doordat het op de retina
geprojecteerd wordt. De parallelle, oneindige lijnen worden gefocusseerd
doordat er meer ruimte gecreëerd wordt door een extra lens en zo kunnen we
een reëel beeld maken.
De kwaliteit van de microscoop is afhankelijk van de settings. Hierop kan
ingespeeld worden door te spelen met conjugate vlakken. Dit zijn vlakken waar
het beeld scherp is.
De rode pijlen duiden de conjugate vlakken aan. Hier is
het beeld scherp. Echter zijn er nog twee bijkomende
conjugate vlakken: waar het objectief het object gaat
projecteren enerzijds, en het veld diafragma anderzijds
(hoeveel licht erdoor gaat).
Ook het belichtingspad heeft conjugate vlakken
(blauw); waar het lampenfilament echt scherp is. Dit is
bij focale punten. Via deze vlakken kan de intensiteit
gereguleerd worden → contrast.
Köhler belichting: homogene belichting
1.5 OPTISCHE COMPONENTEN SPECIFICATIES
1.5.1 RESOLUTIE LIMIET
De resolutie limiet is een maatstaf voor het
vermogen van de objectieflens om in het beeld 2
punten van elkaar te onderscheiden. Echter is geen
enkele lens perfect dus gaan we geen exacte punten
zien, maar een diffractie patroon. We zien een
centrale bol die omgeven wordt door concentrische
ringen, ook wel een airy patroon genoemd. Deze bol heeft een bepaalde grootte maar ga je niet kleiner krijgen
door een lens dan 200 nm, dit is de resolutie limiet.
Wanneer we airy patronen dichter bij elkaar brengen, gaan die
versmelten waardoor ook het oculair ze niet meer van elkaar
kan onderscheiden. Dit is de resolutielimiet. Bepalend voor een
specifiek objectief, microscoop. Die gaat nooit veel beter zijn
dan 200 nm.
1.5.2 CONTRAST
We moeten nog voldoende contrast hebben tussen licht en donker om iets te kunnen zien. Dan mag de
resolutie nog zo fijn zijn, zonder dit contrast zien we niks. Contrast en resolutie zijn nauw verbonden met
elkaar.
We zien hier een raster met zwarte en witte lijnen die echt blokken zijn. Zwart = 0 en wit = 100. Als we daar een
lijn door trekken, krijgen we een blokpatroon met harde randen die van 0 tot 100 gaan. Een signaal gaat
1.1 INTRODUCTIE
Het menselijke oog is aanpasbaar aan verschillende omstandigheden, maar wel beperkt in mogelijkheden. We
zien een variabele focus van de lens met een geïnverteerde afbeelding. De iris is een circulair diafragma en
dient als afscherming om de cornea te beschermen. De retina is een scherm met een enorm bereik en hoge
resolutie (resolving power) door neuronen en fotoreceptoren. Deze laatste kunnen we onderverdelen in
staafjes en kegeltjes met verschillende gevoeligheden. Wel is het oog beperkt in vermogen en vergroting. Ons
maximaal onderscheidend vermogen is beperkt, namelijk tot 0,1 mm.
Een lens vergroot. Dit is makkelijker voor het oog om het onderscheid te maken. Lenzen bestaan al heel lang.
Met 2 lenzen kunnen we nog meer vergroten en een grotere afstand creëren waardoor we objecten nog beter
kunnen bekijken. De eerste microscoop is een omgekeerde telescoop. Er is een lens om te vergroten en dan
een lens om het te projecteren op het netvlies.
1.2 GOLFEIGENSCHAPPEN VAN LICHT
1.2.1 SPECTRUM
Het zichtbare licht is slechts een mini fractie van het EM spectrum. Het heeft een bereik tussen 400 en 700 nm:
van het UV-achtige blauw (400 nm) tot het groen (500 nm) naar het rode licht (700 nm).
1.2.2 REFRACTIE
Licht heeft een bepaalde snelheid in vacuüm. In een andere middenstof gaat die snelheid vertragen. Dit
concept heet refractie. Elk medium dat vertraagt heeft een bepaalde brekingsindex (n). Hoe hoger deze index,
hoe trager het licht zich hierin verplaatst.
Als licht niet recht zou invallen, maar schuin, gaat het licht breken want het licht buigt af. Als het licht breekt
van ijl naar dicht (van lage n naar hoge n), breekt het naar de normaal toe. Van dicht naar ijl is van de normaal
weg.
1.2.3 DISPERSIE
Breking of refractie is voor wit licht maar elke golflengte reageert hier verschillend
op. Blauw gaat harder afbuigen dan rood licht. Daarom is de hemel ook blauw. Je
krijgt een uitspreiding omgekeerd evenredig met de golflengte. Dit heet dispersie.
, Onder een bepaalde hoek zien we totale reflectie. Hier is de
invallende hoek even groot als de terugkaatsende hoek. Deze
hoek is de kritische hoek.
1.2.4 DIFFRACTIE
Een golf begint uit te buigen wanneer het een kleine opening passeert.
De grootte van de opening wordt bepaald door de golflengte.
Diffractie vindt enkel plaats wanneer de opening kleiner is dan de
golflengte. Na de opening zien we een sferische golf.
Het oplossend vermogen is het vermogen van het optische instrument om
afzonderlijke beelden te produceren van 2 aangrenzende punten.
Het licht dat eruit komt gaat niet meer in een vlotte beweging bewegen.
We krijgen licht dat later aankomt en gaat met zichzelf beginnen
interfereren. Twee van dergelijke diffractiepatronen beginnen met
elkaar te interfereren: sterker effect als ze tegelijk zijn (constructieve
interferentie), minder sterk effect als ze niet perfect simultaan liggen
(destructieve interferentie). Bij constructieve interferentie wordt de
amplitude 2x zo groot. Bij destructieve interferentie is er een halve golflengte verschil. Hierdoor zal het
minimum samenvallen met het maximum waardoor de golven elkaar uitdoven.
1.3 LENS THEORIE
Een perfecte convexe lens heeft een focaal punt, het punt waarop het licht wordt gefocusseerd.
1.3.1 REGELS LENSTHEORIE
1. Parallelle stralen convergeren naar een focaal punt.
2. Licht dat uit het focaal punt komt, gaat perfect parallel uitschijnen.
3. Stralen die door het centrum gaan, worden niet afgebogen.
,1.3.2 CONVEXE LENS VERGROTING
Adhv 3 lijnen kijken we waar het object zich bevindt.
- Parallelle lijn met optische as die afbuigt door het focaal punt
- 2e lijn die door het focaal punt gaat
- 3e lijn door het midden van de lens, ongehinderd
Obv hiervan kan je tekenen en visualiseren waar het object zich bevindt
Focale afstand (f): tussen het centrum van de lens en focaal punt.
Di: afstand tot object
SITUATIE 1: VOORWERPSAFSTAND IS GROTER DAN 2F
1 1 1
+ = => di = 3/2f M = -1/2 (neg want omgekeerd)
3𝑓 𝑑𝑖 𝑓
Het beeld is verkleind, reëel, geïnverteerd en het staat verder. Een voorbeeld hiervan is een foto van een
landschap.
SITUATIE 2: VOORWERPSAFSTAND IS GELIJK AAN 2F
1/di = 1/2f => di = 2f M = -1
Het beeld is even groot, reëel, geïnverteerd en het staat even ver. Een voorbeeld hiervan is een portretfoto.
SITUATIE 3: VOORWERPSAFSTAND LIGT TUSSEN F EN 2F
Di = 3f M = -2
Het beeld is groter, reëel, geïnverteerd en het staat verder.
SITUATIE 4: VOORWERPSAF STAND IS GELIJK AAN F
Di = 0 M = oneindig
We krijgen geen beeld dus we krijgen een object op oneindig want de lijnen
gaan parallel. Dit is handig bij microscopen want we krijgen een oneindige
ruimte waar we kunnen spelen met lenzen. Met een tweede lens kan het beeld
gecapteerd worden.
SITUATIE 5: VOORWERPSAFSTAND IS KLEINER DA N F
Di = -f M = +2
Het beeld is groter, virtueel, rechtopstaand en het staat aan dezelfde kant als
het object. Dit zien we bij een loupe.
1.4 OPTISCHE TREIN VAN ONDERDELEN MICROSCOOP
Dit is een transmissie microscoop. Die bestaat uit:
Lichtbron – lens om te focusseren (condensor) –
vergroting: objectief – oculair gaat fungeren als
een extra vergroting om een virtueel beeld te
creëren naar het oog.
We zien dus een tweestapsproces: Mtot= Mobj * Moc
, Het objectief gaat het object vergroten. Het reële beeld ligt dichter bij de lens
dan de brandpuntafstand dus we gaan een virtueel beeld vormen na het oculair.
Dat wordt uiteindelijk toch een reëel beeld doordat het op de retina
geprojecteerd wordt. De parallelle, oneindige lijnen worden gefocusseerd
doordat er meer ruimte gecreëerd wordt door een extra lens en zo kunnen we
een reëel beeld maken.
De kwaliteit van de microscoop is afhankelijk van de settings. Hierop kan
ingespeeld worden door te spelen met conjugate vlakken. Dit zijn vlakken waar
het beeld scherp is.
De rode pijlen duiden de conjugate vlakken aan. Hier is
het beeld scherp. Echter zijn er nog twee bijkomende
conjugate vlakken: waar het objectief het object gaat
projecteren enerzijds, en het veld diafragma anderzijds
(hoeveel licht erdoor gaat).
Ook het belichtingspad heeft conjugate vlakken
(blauw); waar het lampenfilament echt scherp is. Dit is
bij focale punten. Via deze vlakken kan de intensiteit
gereguleerd worden → contrast.
Köhler belichting: homogene belichting
1.5 OPTISCHE COMPONENTEN SPECIFICATIES
1.5.1 RESOLUTIE LIMIET
De resolutie limiet is een maatstaf voor het
vermogen van de objectieflens om in het beeld 2
punten van elkaar te onderscheiden. Echter is geen
enkele lens perfect dus gaan we geen exacte punten
zien, maar een diffractie patroon. We zien een
centrale bol die omgeven wordt door concentrische
ringen, ook wel een airy patroon genoemd. Deze bol heeft een bepaalde grootte maar ga je niet kleiner krijgen
door een lens dan 200 nm, dit is de resolutie limiet.
Wanneer we airy patronen dichter bij elkaar brengen, gaan die
versmelten waardoor ook het oculair ze niet meer van elkaar
kan onderscheiden. Dit is de resolutielimiet. Bepalend voor een
specifiek objectief, microscoop. Die gaat nooit veel beter zijn
dan 200 nm.
1.5.2 CONTRAST
We moeten nog voldoende contrast hebben tussen licht en donker om iets te kunnen zien. Dan mag de
resolutie nog zo fijn zijn, zonder dit contrast zien we niks. Contrast en resolutie zijn nauw verbonden met
elkaar.
We zien hier een raster met zwarte en witte lijnen die echt blokken zijn. Zwart = 0 en wit = 100. Als we daar een
lijn door trekken, krijgen we een blokpatroon met harde randen die van 0 tot 100 gaan. Een signaal gaat
