Analyse van Nano materialen les 1 -2
https://www.youtube.com/watch?v=o_IpWcWKNXI
ITC wordt in de praktijk gebruikt om de reactiewarmte van bindingen tussen macromoleculen en
liganden te meten, bijvoorbeeld: eiwit – DNA, eiwit- lipide, enzyme – inhibitor etc. Bij de binding van
een ligand op e+ en macromolecuul kan warmte vrij komen, of er is warmte voor nodig, dit is
afhankelijk van de soort binding. Het warmte effect wordt weergegeven met het symbool ∆H.
Met een ITC experiment kan de binding affiniteit (Kd) worden gemeten, de energie ∆H (warmte
effect, en het aantal bindingplaatsen van een macromolecuul voor een bepaald ligand.
De titratie: op het moment dat je voor de eerste keer het ligand toevoegt aan het macromolecuul, zal
het ligand nog helemaal kunnen binden op het macromolecuul. Hierbij komt warmte vrij. Deze
warmte kun je waarnemen als een piek in de grafiek. Vervolgens voeg je weer ligand toe aan je
macromolecuul, ook nu zal het ligand volledig kunnen binden aan het macromolecuul. Naar mate je
vaker het ligand toevoegt zal het macromolecuul verzadigd raken, er komt steeds minder warmte
vrij. Dit kun je waarnemen in minder hoge pieken in de grafiek. Uiteindelijk za het macromolecuul
helemaal verzadigd zijn en zal je geen bindingsenergie meer waarnemen. Het macromolecuul in
ligand worden over het algemeen toegevoegd in micromolair hoeveelheden, dus zeer lage
concentraties. In de curve wordt ucal/sec uitgezet tegen de tijd.
De data die wordt verkregen kan je vervolgens uitzetten in een nieuwe grafiek. Hiebij wordt het
aantal kcal/mol uitgezet tegen de molaire ratio. Uit de grafiek kun je nu verschillenden dingen halen:
- Het warmte effect: ∆H (hoogste piek, dus de eerste)
- Stoichiometrie buigpunt van de curve
- Associatie constante = bindings affiniteit = Kb
, Kb = bindingconstante. Ook wordt Ka gebruikt. Ka = associatie constante. Komt op het zelfde neer.
De Kb of Ka bereken je als volgt:
[AB] / [A] * [B].
Met hierin: AB als macromolecuul – ligand complex, A het macromolecuul en B het ligand.
Het antwoord wordt altijd gegeven in: molair. 1 uM = 10 -6 M.
Kd = dissociatie constante, dus het omgekeerde van de Kb of Ka. Om de Kd te berekenen deel doe je:
1/Kb. Dit komt dus neer op de volgende formule:
([A] * [B]) / [AB].
Met hierin: AB als macromolecuul – ligand complex, A het macromolecuul en B het ligand.
Het antwoord wordt altijd gegeven in: molair. 1 uM = 10 -6 M.
Een reactie kan alleen verlopen als de algemene energie van deelnemende stoffen er beter op wordt.
Om dit te kunnen berekenen kun je gebruik maken van de volgende formule:
∆G = ∆H – T*∆S
Met hierin:
∆H als verandering van het warmte effect = enthalpie
∆G als verandering van vrije energy = Gibbs free energy
∆S als verandering van wanorde = entropie
T als absolute temperatuur, dus temp in kelvin (0 graden Celsius = 273 kelvin)
(∆S: je moet energie toevoegen aan een systeem om de wanorde om gelijk niveau te houden, elk
systeem streeft naar de grootste wanorde, ∆S is altijd positief. Bij ∆S wordt vooral naar hydrofobe
interacties gekeken.)
(∆G: is nodig om te bepalen of een reactie zal verlopen, een reactie verloopt spontaal als ∆G < 0, hoe
meer negatief ∆G, hoe beter een reactie zal verlopen)
(∆H: maat van energie afkomstig van opbouw en afbraak van bindingen. Dominante bijdrage komt
van waterstofbruggen. Als ∆H negatief is dan zal de ∆G als snel richting negatief gaan, tenzij ∆S heel
groot wordt.)
https://www.youtube.com/watch?v=o_IpWcWKNXI
ITC wordt in de praktijk gebruikt om de reactiewarmte van bindingen tussen macromoleculen en
liganden te meten, bijvoorbeeld: eiwit – DNA, eiwit- lipide, enzyme – inhibitor etc. Bij de binding van
een ligand op e+ en macromolecuul kan warmte vrij komen, of er is warmte voor nodig, dit is
afhankelijk van de soort binding. Het warmte effect wordt weergegeven met het symbool ∆H.
Met een ITC experiment kan de binding affiniteit (Kd) worden gemeten, de energie ∆H (warmte
effect, en het aantal bindingplaatsen van een macromolecuul voor een bepaald ligand.
De titratie: op het moment dat je voor de eerste keer het ligand toevoegt aan het macromolecuul, zal
het ligand nog helemaal kunnen binden op het macromolecuul. Hierbij komt warmte vrij. Deze
warmte kun je waarnemen als een piek in de grafiek. Vervolgens voeg je weer ligand toe aan je
macromolecuul, ook nu zal het ligand volledig kunnen binden aan het macromolecuul. Naar mate je
vaker het ligand toevoegt zal het macromolecuul verzadigd raken, er komt steeds minder warmte
vrij. Dit kun je waarnemen in minder hoge pieken in de grafiek. Uiteindelijk za het macromolecuul
helemaal verzadigd zijn en zal je geen bindingsenergie meer waarnemen. Het macromolecuul in
ligand worden over het algemeen toegevoegd in micromolair hoeveelheden, dus zeer lage
concentraties. In de curve wordt ucal/sec uitgezet tegen de tijd.
De data die wordt verkregen kan je vervolgens uitzetten in een nieuwe grafiek. Hiebij wordt het
aantal kcal/mol uitgezet tegen de molaire ratio. Uit de grafiek kun je nu verschillenden dingen halen:
- Het warmte effect: ∆H (hoogste piek, dus de eerste)
- Stoichiometrie buigpunt van de curve
- Associatie constante = bindings affiniteit = Kb
, Kb = bindingconstante. Ook wordt Ka gebruikt. Ka = associatie constante. Komt op het zelfde neer.
De Kb of Ka bereken je als volgt:
[AB] / [A] * [B].
Met hierin: AB als macromolecuul – ligand complex, A het macromolecuul en B het ligand.
Het antwoord wordt altijd gegeven in: molair. 1 uM = 10 -6 M.
Kd = dissociatie constante, dus het omgekeerde van de Kb of Ka. Om de Kd te berekenen deel doe je:
1/Kb. Dit komt dus neer op de volgende formule:
([A] * [B]) / [AB].
Met hierin: AB als macromolecuul – ligand complex, A het macromolecuul en B het ligand.
Het antwoord wordt altijd gegeven in: molair. 1 uM = 10 -6 M.
Een reactie kan alleen verlopen als de algemene energie van deelnemende stoffen er beter op wordt.
Om dit te kunnen berekenen kun je gebruik maken van de volgende formule:
∆G = ∆H – T*∆S
Met hierin:
∆H als verandering van het warmte effect = enthalpie
∆G als verandering van vrije energy = Gibbs free energy
∆S als verandering van wanorde = entropie
T als absolute temperatuur, dus temp in kelvin (0 graden Celsius = 273 kelvin)
(∆S: je moet energie toevoegen aan een systeem om de wanorde om gelijk niveau te houden, elk
systeem streeft naar de grootste wanorde, ∆S is altijd positief. Bij ∆S wordt vooral naar hydrofobe
interacties gekeken.)
(∆G: is nodig om te bepalen of een reactie zal verlopen, een reactie verloopt spontaal als ∆G < 0, hoe
meer negatief ∆G, hoe beter een reactie zal verlopen)
(∆H: maat van energie afkomstig van opbouw en afbraak van bindingen. Dominante bijdrage komt
van waterstofbruggen. Als ∆H negatief is dan zal de ∆G als snel richting negatief gaan, tenzij ∆S heel
groot wordt.)
