DNA TECHONOLOGIE II
INHOUD
Mutaties en het ontstaan van kanker ................................................................................................................ 6
Kenmerken tumorcellen ................................................................................................................................ 6
Switch van goedaardige tumor naar kwaadaardige tumor.......................................................................... 7
Verwijderen tumoren is niet mogelijk via chirurgie .................................................................................... 7
Proto-oncogenen, oncogenen en tumorsuppressorgenen.............................................................................. 7
Tumormerkers .......................................................................................................................................... 8
Delingsactiviteit wordt beïnvloed door ...................................................................................................... 8
Wordt kanker overgeërfd? ............................................................................................................................ 9
Uitschakelen van tumorsuppressorgenen ...................................................................................................... 9
Onderscheid sporadisch of niet – overgeërfde vorm en familiaal of overgeërfde vorm ............................... 9
Meerstappentheorie (Multi hit theory)........................................................................................................ 10
Aantal tumorsuppressorgenen ................................................................................................................ 11
Aantal oncogenen ................................................................................................................................... 11
Groeiend belang van tumormerkers ............................................................................................................ 12
FOBT (Fecal Occult Blood test) ................................................................................................................. 13
PAP-test (Papanicolaou test) ................................................................................................................... 13
Technieken voor diagnose van moleculaire merkers ................................................................................ 14
Liquid biopsie.............................................................................................................................................. 14
NIPT test ................................................................................................................................................. 15
Doelgerichte therapieën, nieuwe wapens in de strijd .................................................................................. 15
Monoklonale antilichamen ...................................................................................................................... 16
Tyrosine Kinase Inhibitoren (TKI) ............................................................................................................. 17
Voorbeelden van carcinoma’ s .................................................................................................................... 18
Colorectale tumoren (uitleggen + vragen beantwoorden) ........................................................................ 18
Borsttumoren.......................................................................................................................................... 19
Voorbeeldvragen Kanker................................................................................................................................. 19
Is kanker overerfbaar? Motiveer ................................................................................................................. 19
3 meest voorkomende kankers bij mannen en vrouwen .............................................................................. 19
Hoe diagnose voor tumor/kanker stellen? Manieren om tumoren op te sporen + geef alle mogelijke
tumormerkes .............................................................................................................................................. 20
Therapie voor het bestrijden van kanker ..................................................................................................... 20
Op welk vlak werken de geneesmiddelen .................................................................................................... 21
Welke zijn de jongste generatie veelbelovende geneesmiddelen ................................................................. 21
1
, Hoe werken mAB tegen kankers (4 manieren) ............................................................................................. 21
Wat weet je over een oncogen? Geef voorbeelden ..................................................................................... 22
Wat weet je over een tumorsuppresorgen? Geef voorbeelden .................................................................... 22
2 hit-theorie van Knudson ........................................................................................................................... 22
het ontstaan van kanker/tumor is een meerstapsproces. Leg uit ................................................................. 23
Gebruik van E-coli stammen en restrictie-enzymen in klassieke kloneringsmethoden ...................................... 24
Restrictie-enzymen ..................................................................................................................................... 24
3 types van restrictie enzymen ................................................................................................................ 24
Speciale restrictie-enzymen in E. coli ....................................................................................................... 25
Type II restrictie-enzymen ........................................................................................................................... 25
Modifying enzymen ............................................................................................................................. 26
Types van herkende sequenties................................................................................................................... 26
Te onderscheiden knipwijzen ...................................................................................................................... 28
Blunt eindjes ........................................................................................................................................... 28
Sticky eindjes .......................................................................................................................................... 28
Frequentie van voorkomen van restrictieplaatsen ....................................................................................... 28
Invloed van de omgevende sequentie op de knip efficiëntie ........................................................................ 28
Manieren van knippen van de herkende sequentie...................................................................................... 29
Begrippen: Prototype – Isoschizomeer – neoschizomeer ............................................................................. 29
Invloed van methylatie op het knippen van type II restrictie – enzymen....................................................... 30
Dam en Dcm methylatie .......................................................................................................................... 30
CpG en CpNpG methylatie in eukaryoten ................................................................................................. 31
Gebruik van restrictie – enzymen .................................................................................................................... 31
Definitie Unit .............................................................................................................................................. 31
Buffersamenstelling .................................................................................................................................... 31
Temperatuur............................................................................................................................................... 31
Staractiviteit ............................................................................................................................................... 31
Stoppen van de reactie ............................................................................................................................... 32
Knippen van DNA met restrictie – enzymen ................................................................................................. 32
Opstellen van gecombineerde digesten ................................................................................................... 33
Betekenis symbolen............................................................................................................................. 34
Oefeningen staractiviteit – bufferconcentratie ........................................................................................ 34
Staractiviteit ........................................................................................................................................ 34
Bufferconcentratie .............................................................................................................................. 35
Plasmiden ....................................................................................................................................................... 35
Definitie van een plasmide .......................................................................................................................... 35
Structuur plasmide...................................................................................................................................... 36
2
, Antibiotica ’s ........................................................................................................................................... 37
Prokaryotische promotors ....................................................................................................................... 37
Incompatibiliteit.......................................................................................................................................... 38
Gastheerbereik ........................................................................................................................................... 39
Kopijnummer .............................................................................................................................................. 39
E. coli strengen in het labo .............................................................................................................................. 39
E. coli .......................................................................................................................................................... 39
Constructie van een recombinant plasmide via klonering met T4 DNA ligase ................................................... 39
Definitie basale kloneringsvector................................................................................................................. 39
Kloneren in praktijk ................................................................................................................................. 40
Oefeningen ......................................................................................................................................... 41
Constructie van een recombinant plasmide via klonering met topoimerase ..................................................... 42
De TOPO TA kloneringstechniek .................................................................................................................. 42
Positieve selectie CCdb – gen................................................................................................................... 42
Gibson Assembly Cloning ................................................................................................................................ 43
Principe van de techniek ............................................................................................................................. 43
Toepassing Gibson Assembly – Nucleotiden niveau ................................................................................. 44
............................................................................................................................................................... 44
Golden Gate Cloning ....................................................................................................................................... 45
Doel van het kloneren via gateway .............................................................................................................. 45
BP reactie ................................................................................................................................................... 46
LR reactie .................................................................................................................................................... 46
Synthese en klonering van cDNA ..................................................................................................................... 47
Doel cDNA banken ...................................................................................................................................... 47
RNA bereiding ............................................................................................................................................. 47
Bereiding totaal RNA (Stappen kennen + uitleggen) ................................................................................. 47
Isolatie van de Poly A+ fractie = mRNA ........................................................................................................ 49
Afzonderen van mRNA ............................................................................................................................ 49
Synthese van cDNA ......................................................................................................................................... 50
Smart Race cDNA amplification ................................................................................................................... 50
Klonering van cDNA ........................................................................................................................................ 51
Homopolymeer tailing................................................................................................................................. 51
Adaptors ..................................................................................................................................................... 53
Transformatie ................................................................................................................................................. 54
Screenen van de bank ..................................................................................................................................... 54
Klonering van RNA’s die geen poly – A staart dragen ....................................................................................... 54
RACE of Rapid Amplification of cDNA ends ...................................................................................................... 54
3
, 5’ RACE ....................................................................................................................................................... 55
3’ RACE ....................................................................................................................................................... 56
Toepassing Race of cDNA ends (Kunnen op het examen) ............................................................................. 57
Maak het 5’ en 3’ RACE product en kloneer het in de vector Maak zelf de 5’ RACE en 3’ Race producten en
ligeer ze in onderstaande vector (typische examenvraag) ........................................................................ 57
In vitro gekoppelde transcriptie-translatie systemen ....................................................................................... 59
Merkingstechnieken voor het aangemaakt eiwit ......................................................................................... 60
Expressie van gekloneerde genen in E. coli ...................................................................................................... 61
Waarom expressie in E. coli ......................................................................................................................... 61
Decodering van de genetische informatie: transcriptie ............................................................................ 62
Decodering van de genetische informatie : translatie............................................................................... 62
Decodering van de genetische informatie : secundaire modificaties ......................................................... 63
Algemene opbouw en gewenste eigenschappen van een expressievector ................................................... 63
Een expressievector voor expressie in E. coli ............................................................................................ 63
Toegankelijkheid van het ATG codon van de expressievector ................................................................... 64
5’ sticky knipper; voorbeeld NcoI ......................................................................................................... 64
3’ sticky knipper; voorbeeld Kpn I ........................................................................................................ 64
Toegankelijkheid van het eerste gewenste codon van het mature eiwit in het cDNA ................................ 65
Quick Change Site Directed Mutagenese – PCR (Oefeningen kunnen maken) ............................................... 65
Voorbeeld ............................................................................................................................................... 65
Oefening ............................................................................................................................................. 66
Overzicht van veel gebruikte promotors en hun regulatie................................................................................ 68
Belang van reguleerbaarheid....................................................................................................................... 68
Lek – expressie ........................................................................................................................................ 69
Factoren die de finale opbrengst van een eiwit bepalen........................................................................... 69
pET expression vectors................................................................................................................................ 69
Expressie van recombinant eiwit in Pichia pastoris .......................................................................................... 70
Cellulaire oorsprong van het product .......................................................................................................... 70
Expressie in Pichia pastoris .......................................................................................................................... 71
Stabiele integratie van expressieconstructen in het genoom .................................................................... 71
Alcohol oxidase promotor en het Alfa mating signaal............................................................................... 72
Belang codon optimalisatie ..................................................................................................................... 73
Kloonselectie .............................................................................................................................................. 74
Fermentatie ................................................................................................................................................ 74
Multicistronische boodschappers .................................................................................................................... 75
IRES – mechanisme ..................................................................................................................................... 75
2A peptide .................................................................................................................................................. 76
4
,Modificatie – enzymen gebruikt in de recombinante DNA – technologie ......................................................... 77
Begrippenlijst DNA technologie II .................................................................................................................... 79
5
,MUTATIES EN HET ONTSTAAN VAN KANKER
KENMERKEN TUMORCELLEN
➔ Gestegen proliferatie (beïnvloeding van celcyclus)
o Proliferatie = algemene groei of verspreiding
➔ Dedifferentatie of Anaplasie
o Anaplasie = Het verschijnsel waarbij celdeling en celgroei zodanig veranderen dat de
differentiatie in de cellen, waaruit een weefsel is opgebouwd, afneemt.
➔ Gedeelde contact-inhibitie
➔ Geen apoptose (celdood)
➔ Stimulatie van bloedvaten (angiogenese)
o Angiogenese = de vorming van nieuwe bloedvaten
vanuit bestaande bloedvaten
➔ Onderscheid maken tussen:
o Goedaardige tumoren (Benign)
o Kwaadaardige tumoren (Malign) (invasie en metastase)
▪ Metastase = Tumorcellen verspreiding via
bloedvaten (uitzaaiing) naar omliggende
weefsel
➔ Meest voorkomende kankers
o Mannen → Prostaat, long en darmkanker
o Vrouwen → Baarmoeder, borst, long en darmkanker
▪ Welk weefsel? → Epitheelweefsel; kanker = een carcinoom
▪ Weke delen tumoren = Rhabdomyosarcoma (RMS); spieren, bindweefsel en
gewrichten
➔ Tumor heterogeniteit
o Binnen 1 tumor kunnen verschillende tumorcellen voorkomen
6
,SWITCH VAN GOEDAARDIGE TUMOR NAAR KWAADAARDIGE TUMOR
➔ Bij metastasering komen tumorcellen (A) los van de primaire tumor (B) en banen zich een weg door
naburig weefsel en infiltreren vervolgens de bloed – en lymfevaten (C).
➔ Van daaruit hebben de tumorcellen toegang tot andere organen en weefsel en dit is de oorzaak van
secundaire tumoren.
VERWIJDEREN TUMOREN IS NIET MOGELIJK VIA CHIRURGIE
➔ Selectief kankercellen doden kan via:
o Radiotherapie (bestraling)
o Chemotherapie (systemische behandeling met medicijnen)
▪ Kan effectief zijn als de concentratie in en rond de tumorcellen voldoende hoog is
▪ Te lage concentratie → tumorcellen hebben de tijd om resistentie te ontwikkelen
(Ongevoeligheid voor behandeling)
o Doelgerichte therapie
PROTO-ONCOGENEN, ONCOGENEN EN TUMORSUPPRESSORGENEN
➔ Proto-oncogenen
o Zijn normaal voorkomende groeibevorderende genen die door mutaties omgezet kunnen
worden tot oncogenen (vb. door puntmutatie, amplificatie, translocatie,..)
▪ Amplificatie zorgt voor het ontstaan kopieën van het gen, waardoor een teveel aan
groeibevorderende eiwitten ontstaan
▪ Translocatie het gen komt om een andere plaats of chromosoom terecht
➔ Oncogenen
o Normaal groeibevorderende genen die door mutaties overactief zijn
o Zijn genen die massale celgroei teweegbrengen
▪ Een mutatie in 1 allel zorgt al voor het ontstaan van kankers
7
, ➔ Tumorsuppressorgenen of anti-oncogenen
o Groei onderdrukkende genen, tumorvorming in gezonde cellen onderdrukken
o Als ze door een mutatie hun vermogen verliezen om celdelingen tegen te gaan als er
voldoende cellen in het weefsel aanwezig zijn, dan zijn zij ook verantwoordelijk voor het
ontstaan van kanker
o Ook zijn er tumorsuppressorgenen die cel apoptose in gang zetten door intern of extern
signaal
▪ Intern signaal → DNA – schade
▪ Extern signaal → afkomstig van immuunsysteem
➔ Activatie van oncogenen
1) Wegnemen van methylgroepen
2) Gewijzigde expressie van bepaald miRNA (micro-RNA)
3) Mutatie
➔ Inactivatie van tumorsuppressorgenen
1) Methylering van bepaalde genen
2) Gewijzigde expressie van miRNA (micro-RNA)
3) Mutatie
TUMORMERKERS
➔ Mutaties:
o Oncogenen vb. Mutatie in het ras oncogen (1 allel)
o Tumorsuppressorgenen: mutaties in BRCA1 (beide allelen)
➔ Methylering
o Histonmodificatie (epigenetica)
➔ Micro – RNA
o Reguleren:
▪ Transcriptie
▪ RNA stabiliteit
▪ Translatie
➔ Specifieke eiwitten meten in bloed- of urinestalen
DELINGSACTIVITEIT WORDT BEÏNVLOED DOOR
➔ Uitwendige factoren:
o Chemische stoffen
o Biologische oorzaken: virus, bacterie
o Fysische oorzaken: straling
➔ Inwendige factoren:
o Groeifactoren
o Invloed ontwikkelingsperiode
8
,WORDT KANKER OVERGEËRFD?
➔ Nee, kanker wordt niet overgeërfd.
o Het ontstaat in 1 of meerdere lichaamscellen als gevolg van blootstelling aan
omgevingsfactoren die het genetisch materiaal kunnen beschadigen
➔ In sporadisch voorkomende kankergevallen is de mutatie eerst overgeërfd
o Een defect kwam al voor in de ei – of zaadcel waaruit het individu ontstaan is
o Als zo’n mutatie overgeërfd wordt, dan heeft deze persoon in de loop van zijn leven een
groter risico om een echte kanker te ontwikkelen
UITSCHAKELEN VAN TUMORSUPPRESSORGENEN
➔ Retinoblastoom
o Is een kanker van het netvlies of retina van het oog
o Verantwoordelijk gen is het Rb-gen dat ligt op de lange arm van chromosoom 13
o In retinoblastoomcellen is het afwezig, waardoor deze cellen een ongecontroleerde groei
kennen
➔ Ontstaan retinoblastoom:
o Als beide Rb-genen ofwel gemuteerd zijn ofwel verdwenen zijn
ONDERSCHEID SPORADISCH OF NIET – OVERGEËRFDE VORM EN FAMILIAAL OF OVERGEËRFDE
VORM
Sporadisch of niet – overgeërfde vorm Familiaal of overgeërfde vorm
• Beide Rb-genen moeten op de één of • Een puntmutatie in 1 van de Rb-genen
andere manier gemuteerd of verdwenen wordt overgeërfd door 1 van de ouders
zijn in 1 zelfde retinacel o Alle retinacellen vertonen deze
mutatie doordat deze al in de
• Die ene cel vertoont een ongecontroleerde zygote aanwezig is
groei en vormt een kankergezwel
• Als 1 van deze retinacellen onder invloed
van uitwendige factoren een 2de Rb-gen
raakt ontstaat een kankergezwel
o Two hit Theorie van Knudson
2 mutaties nodig voor
kankervorming
9
, MEERSTAPPENTHEORIE (MULTI HIT THEORY)
➔ Vaststelling:
o Kanker is het gevolg van een reeks van opeenvolgende mutaties binnen eenzelfde cel
o Voor retinoblastoom zijn er 2 mutaties nodig in 1 allenpaar
Darmepitheel
➔ Stadia in ontwikkeling van dikke darmkanker
o Door opeenvolgende mutaties kan het epitheel op bepaalde plaatsen eerst ontaarden in een
weefsel met afwijkende celtypes
o Vervolgens kunnen er zich goedaardige gezwellen of poliepen vormen
o Deze nemen in omvang toe totdat ze uiteindelijk uitgroeien tot kwaadaardige
kankergezwellen
➔ APC, DCC en p53 → zijn tumorsuppressorgenen
➔ RAS → is een oncogen
10
INHOUD
Mutaties en het ontstaan van kanker ................................................................................................................ 6
Kenmerken tumorcellen ................................................................................................................................ 6
Switch van goedaardige tumor naar kwaadaardige tumor.......................................................................... 7
Verwijderen tumoren is niet mogelijk via chirurgie .................................................................................... 7
Proto-oncogenen, oncogenen en tumorsuppressorgenen.............................................................................. 7
Tumormerkers .......................................................................................................................................... 8
Delingsactiviteit wordt beïnvloed door ...................................................................................................... 8
Wordt kanker overgeërfd? ............................................................................................................................ 9
Uitschakelen van tumorsuppressorgenen ...................................................................................................... 9
Onderscheid sporadisch of niet – overgeërfde vorm en familiaal of overgeërfde vorm ............................... 9
Meerstappentheorie (Multi hit theory)........................................................................................................ 10
Aantal tumorsuppressorgenen ................................................................................................................ 11
Aantal oncogenen ................................................................................................................................... 11
Groeiend belang van tumormerkers ............................................................................................................ 12
FOBT (Fecal Occult Blood test) ................................................................................................................. 13
PAP-test (Papanicolaou test) ................................................................................................................... 13
Technieken voor diagnose van moleculaire merkers ................................................................................ 14
Liquid biopsie.............................................................................................................................................. 14
NIPT test ................................................................................................................................................. 15
Doelgerichte therapieën, nieuwe wapens in de strijd .................................................................................. 15
Monoklonale antilichamen ...................................................................................................................... 16
Tyrosine Kinase Inhibitoren (TKI) ............................................................................................................. 17
Voorbeelden van carcinoma’ s .................................................................................................................... 18
Colorectale tumoren (uitleggen + vragen beantwoorden) ........................................................................ 18
Borsttumoren.......................................................................................................................................... 19
Voorbeeldvragen Kanker................................................................................................................................. 19
Is kanker overerfbaar? Motiveer ................................................................................................................. 19
3 meest voorkomende kankers bij mannen en vrouwen .............................................................................. 19
Hoe diagnose voor tumor/kanker stellen? Manieren om tumoren op te sporen + geef alle mogelijke
tumormerkes .............................................................................................................................................. 20
Therapie voor het bestrijden van kanker ..................................................................................................... 20
Op welk vlak werken de geneesmiddelen .................................................................................................... 21
Welke zijn de jongste generatie veelbelovende geneesmiddelen ................................................................. 21
1
, Hoe werken mAB tegen kankers (4 manieren) ............................................................................................. 21
Wat weet je over een oncogen? Geef voorbeelden ..................................................................................... 22
Wat weet je over een tumorsuppresorgen? Geef voorbeelden .................................................................... 22
2 hit-theorie van Knudson ........................................................................................................................... 22
het ontstaan van kanker/tumor is een meerstapsproces. Leg uit ................................................................. 23
Gebruik van E-coli stammen en restrictie-enzymen in klassieke kloneringsmethoden ...................................... 24
Restrictie-enzymen ..................................................................................................................................... 24
3 types van restrictie enzymen ................................................................................................................ 24
Speciale restrictie-enzymen in E. coli ....................................................................................................... 25
Type II restrictie-enzymen ........................................................................................................................... 25
Modifying enzymen ............................................................................................................................. 26
Types van herkende sequenties................................................................................................................... 26
Te onderscheiden knipwijzen ...................................................................................................................... 28
Blunt eindjes ........................................................................................................................................... 28
Sticky eindjes .......................................................................................................................................... 28
Frequentie van voorkomen van restrictieplaatsen ....................................................................................... 28
Invloed van de omgevende sequentie op de knip efficiëntie ........................................................................ 28
Manieren van knippen van de herkende sequentie...................................................................................... 29
Begrippen: Prototype – Isoschizomeer – neoschizomeer ............................................................................. 29
Invloed van methylatie op het knippen van type II restrictie – enzymen....................................................... 30
Dam en Dcm methylatie .......................................................................................................................... 30
CpG en CpNpG methylatie in eukaryoten ................................................................................................. 31
Gebruik van restrictie – enzymen .................................................................................................................... 31
Definitie Unit .............................................................................................................................................. 31
Buffersamenstelling .................................................................................................................................... 31
Temperatuur............................................................................................................................................... 31
Staractiviteit ............................................................................................................................................... 31
Stoppen van de reactie ............................................................................................................................... 32
Knippen van DNA met restrictie – enzymen ................................................................................................. 32
Opstellen van gecombineerde digesten ................................................................................................... 33
Betekenis symbolen............................................................................................................................. 34
Oefeningen staractiviteit – bufferconcentratie ........................................................................................ 34
Staractiviteit ........................................................................................................................................ 34
Bufferconcentratie .............................................................................................................................. 35
Plasmiden ....................................................................................................................................................... 35
Definitie van een plasmide .......................................................................................................................... 35
Structuur plasmide...................................................................................................................................... 36
2
, Antibiotica ’s ........................................................................................................................................... 37
Prokaryotische promotors ....................................................................................................................... 37
Incompatibiliteit.......................................................................................................................................... 38
Gastheerbereik ........................................................................................................................................... 39
Kopijnummer .............................................................................................................................................. 39
E. coli strengen in het labo .............................................................................................................................. 39
E. coli .......................................................................................................................................................... 39
Constructie van een recombinant plasmide via klonering met T4 DNA ligase ................................................... 39
Definitie basale kloneringsvector................................................................................................................. 39
Kloneren in praktijk ................................................................................................................................. 40
Oefeningen ......................................................................................................................................... 41
Constructie van een recombinant plasmide via klonering met topoimerase ..................................................... 42
De TOPO TA kloneringstechniek .................................................................................................................. 42
Positieve selectie CCdb – gen................................................................................................................... 42
Gibson Assembly Cloning ................................................................................................................................ 43
Principe van de techniek ............................................................................................................................. 43
Toepassing Gibson Assembly – Nucleotiden niveau ................................................................................. 44
............................................................................................................................................................... 44
Golden Gate Cloning ....................................................................................................................................... 45
Doel van het kloneren via gateway .............................................................................................................. 45
BP reactie ................................................................................................................................................... 46
LR reactie .................................................................................................................................................... 46
Synthese en klonering van cDNA ..................................................................................................................... 47
Doel cDNA banken ...................................................................................................................................... 47
RNA bereiding ............................................................................................................................................. 47
Bereiding totaal RNA (Stappen kennen + uitleggen) ................................................................................. 47
Isolatie van de Poly A+ fractie = mRNA ........................................................................................................ 49
Afzonderen van mRNA ............................................................................................................................ 49
Synthese van cDNA ......................................................................................................................................... 50
Smart Race cDNA amplification ................................................................................................................... 50
Klonering van cDNA ........................................................................................................................................ 51
Homopolymeer tailing................................................................................................................................. 51
Adaptors ..................................................................................................................................................... 53
Transformatie ................................................................................................................................................. 54
Screenen van de bank ..................................................................................................................................... 54
Klonering van RNA’s die geen poly – A staart dragen ....................................................................................... 54
RACE of Rapid Amplification of cDNA ends ...................................................................................................... 54
3
, 5’ RACE ....................................................................................................................................................... 55
3’ RACE ....................................................................................................................................................... 56
Toepassing Race of cDNA ends (Kunnen op het examen) ............................................................................. 57
Maak het 5’ en 3’ RACE product en kloneer het in de vector Maak zelf de 5’ RACE en 3’ Race producten en
ligeer ze in onderstaande vector (typische examenvraag) ........................................................................ 57
In vitro gekoppelde transcriptie-translatie systemen ....................................................................................... 59
Merkingstechnieken voor het aangemaakt eiwit ......................................................................................... 60
Expressie van gekloneerde genen in E. coli ...................................................................................................... 61
Waarom expressie in E. coli ......................................................................................................................... 61
Decodering van de genetische informatie: transcriptie ............................................................................ 62
Decodering van de genetische informatie : translatie............................................................................... 62
Decodering van de genetische informatie : secundaire modificaties ......................................................... 63
Algemene opbouw en gewenste eigenschappen van een expressievector ................................................... 63
Een expressievector voor expressie in E. coli ............................................................................................ 63
Toegankelijkheid van het ATG codon van de expressievector ................................................................... 64
5’ sticky knipper; voorbeeld NcoI ......................................................................................................... 64
3’ sticky knipper; voorbeeld Kpn I ........................................................................................................ 64
Toegankelijkheid van het eerste gewenste codon van het mature eiwit in het cDNA ................................ 65
Quick Change Site Directed Mutagenese – PCR (Oefeningen kunnen maken) ............................................... 65
Voorbeeld ............................................................................................................................................... 65
Oefening ............................................................................................................................................. 66
Overzicht van veel gebruikte promotors en hun regulatie................................................................................ 68
Belang van reguleerbaarheid....................................................................................................................... 68
Lek – expressie ........................................................................................................................................ 69
Factoren die de finale opbrengst van een eiwit bepalen........................................................................... 69
pET expression vectors................................................................................................................................ 69
Expressie van recombinant eiwit in Pichia pastoris .......................................................................................... 70
Cellulaire oorsprong van het product .......................................................................................................... 70
Expressie in Pichia pastoris .......................................................................................................................... 71
Stabiele integratie van expressieconstructen in het genoom .................................................................... 71
Alcohol oxidase promotor en het Alfa mating signaal............................................................................... 72
Belang codon optimalisatie ..................................................................................................................... 73
Kloonselectie .............................................................................................................................................. 74
Fermentatie ................................................................................................................................................ 74
Multicistronische boodschappers .................................................................................................................... 75
IRES – mechanisme ..................................................................................................................................... 75
2A peptide .................................................................................................................................................. 76
4
,Modificatie – enzymen gebruikt in de recombinante DNA – technologie ......................................................... 77
Begrippenlijst DNA technologie II .................................................................................................................... 79
5
,MUTATIES EN HET ONTSTAAN VAN KANKER
KENMERKEN TUMORCELLEN
➔ Gestegen proliferatie (beïnvloeding van celcyclus)
o Proliferatie = algemene groei of verspreiding
➔ Dedifferentatie of Anaplasie
o Anaplasie = Het verschijnsel waarbij celdeling en celgroei zodanig veranderen dat de
differentiatie in de cellen, waaruit een weefsel is opgebouwd, afneemt.
➔ Gedeelde contact-inhibitie
➔ Geen apoptose (celdood)
➔ Stimulatie van bloedvaten (angiogenese)
o Angiogenese = de vorming van nieuwe bloedvaten
vanuit bestaande bloedvaten
➔ Onderscheid maken tussen:
o Goedaardige tumoren (Benign)
o Kwaadaardige tumoren (Malign) (invasie en metastase)
▪ Metastase = Tumorcellen verspreiding via
bloedvaten (uitzaaiing) naar omliggende
weefsel
➔ Meest voorkomende kankers
o Mannen → Prostaat, long en darmkanker
o Vrouwen → Baarmoeder, borst, long en darmkanker
▪ Welk weefsel? → Epitheelweefsel; kanker = een carcinoom
▪ Weke delen tumoren = Rhabdomyosarcoma (RMS); spieren, bindweefsel en
gewrichten
➔ Tumor heterogeniteit
o Binnen 1 tumor kunnen verschillende tumorcellen voorkomen
6
,SWITCH VAN GOEDAARDIGE TUMOR NAAR KWAADAARDIGE TUMOR
➔ Bij metastasering komen tumorcellen (A) los van de primaire tumor (B) en banen zich een weg door
naburig weefsel en infiltreren vervolgens de bloed – en lymfevaten (C).
➔ Van daaruit hebben de tumorcellen toegang tot andere organen en weefsel en dit is de oorzaak van
secundaire tumoren.
VERWIJDEREN TUMOREN IS NIET MOGELIJK VIA CHIRURGIE
➔ Selectief kankercellen doden kan via:
o Radiotherapie (bestraling)
o Chemotherapie (systemische behandeling met medicijnen)
▪ Kan effectief zijn als de concentratie in en rond de tumorcellen voldoende hoog is
▪ Te lage concentratie → tumorcellen hebben de tijd om resistentie te ontwikkelen
(Ongevoeligheid voor behandeling)
o Doelgerichte therapie
PROTO-ONCOGENEN, ONCOGENEN EN TUMORSUPPRESSORGENEN
➔ Proto-oncogenen
o Zijn normaal voorkomende groeibevorderende genen die door mutaties omgezet kunnen
worden tot oncogenen (vb. door puntmutatie, amplificatie, translocatie,..)
▪ Amplificatie zorgt voor het ontstaan kopieën van het gen, waardoor een teveel aan
groeibevorderende eiwitten ontstaan
▪ Translocatie het gen komt om een andere plaats of chromosoom terecht
➔ Oncogenen
o Normaal groeibevorderende genen die door mutaties overactief zijn
o Zijn genen die massale celgroei teweegbrengen
▪ Een mutatie in 1 allel zorgt al voor het ontstaan van kankers
7
, ➔ Tumorsuppressorgenen of anti-oncogenen
o Groei onderdrukkende genen, tumorvorming in gezonde cellen onderdrukken
o Als ze door een mutatie hun vermogen verliezen om celdelingen tegen te gaan als er
voldoende cellen in het weefsel aanwezig zijn, dan zijn zij ook verantwoordelijk voor het
ontstaan van kanker
o Ook zijn er tumorsuppressorgenen die cel apoptose in gang zetten door intern of extern
signaal
▪ Intern signaal → DNA – schade
▪ Extern signaal → afkomstig van immuunsysteem
➔ Activatie van oncogenen
1) Wegnemen van methylgroepen
2) Gewijzigde expressie van bepaald miRNA (micro-RNA)
3) Mutatie
➔ Inactivatie van tumorsuppressorgenen
1) Methylering van bepaalde genen
2) Gewijzigde expressie van miRNA (micro-RNA)
3) Mutatie
TUMORMERKERS
➔ Mutaties:
o Oncogenen vb. Mutatie in het ras oncogen (1 allel)
o Tumorsuppressorgenen: mutaties in BRCA1 (beide allelen)
➔ Methylering
o Histonmodificatie (epigenetica)
➔ Micro – RNA
o Reguleren:
▪ Transcriptie
▪ RNA stabiliteit
▪ Translatie
➔ Specifieke eiwitten meten in bloed- of urinestalen
DELINGSACTIVITEIT WORDT BEÏNVLOED DOOR
➔ Uitwendige factoren:
o Chemische stoffen
o Biologische oorzaken: virus, bacterie
o Fysische oorzaken: straling
➔ Inwendige factoren:
o Groeifactoren
o Invloed ontwikkelingsperiode
8
,WORDT KANKER OVERGEËRFD?
➔ Nee, kanker wordt niet overgeërfd.
o Het ontstaat in 1 of meerdere lichaamscellen als gevolg van blootstelling aan
omgevingsfactoren die het genetisch materiaal kunnen beschadigen
➔ In sporadisch voorkomende kankergevallen is de mutatie eerst overgeërfd
o Een defect kwam al voor in de ei – of zaadcel waaruit het individu ontstaan is
o Als zo’n mutatie overgeërfd wordt, dan heeft deze persoon in de loop van zijn leven een
groter risico om een echte kanker te ontwikkelen
UITSCHAKELEN VAN TUMORSUPPRESSORGENEN
➔ Retinoblastoom
o Is een kanker van het netvlies of retina van het oog
o Verantwoordelijk gen is het Rb-gen dat ligt op de lange arm van chromosoom 13
o In retinoblastoomcellen is het afwezig, waardoor deze cellen een ongecontroleerde groei
kennen
➔ Ontstaan retinoblastoom:
o Als beide Rb-genen ofwel gemuteerd zijn ofwel verdwenen zijn
ONDERSCHEID SPORADISCH OF NIET – OVERGEËRFDE VORM EN FAMILIAAL OF OVERGEËRFDE
VORM
Sporadisch of niet – overgeërfde vorm Familiaal of overgeërfde vorm
• Beide Rb-genen moeten op de één of • Een puntmutatie in 1 van de Rb-genen
andere manier gemuteerd of verdwenen wordt overgeërfd door 1 van de ouders
zijn in 1 zelfde retinacel o Alle retinacellen vertonen deze
mutatie doordat deze al in de
• Die ene cel vertoont een ongecontroleerde zygote aanwezig is
groei en vormt een kankergezwel
• Als 1 van deze retinacellen onder invloed
van uitwendige factoren een 2de Rb-gen
raakt ontstaat een kankergezwel
o Two hit Theorie van Knudson
2 mutaties nodig voor
kankervorming
9
, MEERSTAPPENTHEORIE (MULTI HIT THEORY)
➔ Vaststelling:
o Kanker is het gevolg van een reeks van opeenvolgende mutaties binnen eenzelfde cel
o Voor retinoblastoom zijn er 2 mutaties nodig in 1 allenpaar
Darmepitheel
➔ Stadia in ontwikkeling van dikke darmkanker
o Door opeenvolgende mutaties kan het epitheel op bepaalde plaatsen eerst ontaarden in een
weefsel met afwijkende celtypes
o Vervolgens kunnen er zich goedaardige gezwellen of poliepen vormen
o Deze nemen in omvang toe totdat ze uiteindelijk uitgroeien tot kwaadaardige
kankergezwellen
➔ APC, DCC en p53 → zijn tumorsuppressorgenen
➔ RAS → is een oncogen
10
