BIOTECHNOLOGIE EN
PROTEÏNEGENEESMIDDELEN
1. INLEIDING
BIOLOGISCHE GENEESMIDDELEN = BIOLOGICAL?
= gm gemaakt uit levende organismen (zoals bacteriën, gist, dierlijke of menselijke cellen)
= biologics = biopharmaceuticals???
Manier van produceren (biologische wijze) bepaalt of het een biological is
Synthetische aanmaak => GEEN biologic!
Bloed- en plasmaproducten:
= gm gemaakt dmv bloed van mens
- Bloedtransfusie is geen gm! TENZIJ er aanzienlijke bewerkingen gebeuren
o Bv 'fresh-frozen plasma’ = plasma dat uit donorbloed gehaald en ingevroren is, zodat het
later kan worden toegediend
Wel regelgeving als gm nodig
- EW opgezuiverd uit bloed
o Bv. albumine, immunoglobuline, …
o Geldt uitzonderlijke regelgeving voor
o Mogelijke gevaren die niet bij synthetische wijze voorkomen
▪ Bv virusinfecties bij persoon die bloed doneert
▪ Bij donatie moet hele vragenlijst ingevuld worden om risico’s in te schatten
o Belangrijkste productiestap: opzuivering
▪ Zorgen dat potentiële virale contaminanten uit bloed w gezuiverd
Biotech alternatives of biotechnologische gm
= EW die via recombinant DNA technologie worden aangemaakt
- Kleiner risico op contaminatie virussen MAAR groter risico contaminatie bacteriën
- Doel: EW laten produceren door cellen die van nature dit EW niet (knn) aanmaken -> manipulatie
- Bv. recombinante EW (bv insuline), monoklonale antilichamen (mAb), fusie-EW
Vaccins
- Biotechnologisch bv coronavaccin
- Kunnen ook niet biotechnologisch aangemaakt worden; klassieke oudere vaccins bv
influenzavaccin
o Virus w opgekweekt in kippeneieren en zo vermenigvuldigd en opgezuiverd, dan virus
verzwakken en toedienen => biologisch maar niet biotechnologisch
- Bespreking in cursus immunologie
ATMPs
= geavanceerde therapie-gm
- Gebaseerd op genen, weefsels of cellen
- Bv. cel en gentherapie, tissue engineered gm, CAR-T celtherapie, mRNA
o CAR-T celtherapie = behandeling waarbij eigen afweercellen (T-cellen) van patiënt
worden aangepast zodat ze kankercellen beter kunnen herkennen en vernietigen
o Tissue engineerd gm = organen die in bedrijf geproduceerd worden bv beenmerg
(stamcellen), hart, lever…
, o mRNA-vaccins: worden op relatief eenvoudige manier geproduceerd dus classificatie
ATMP is discussieerbaar
- opletten voor statement on unregulated advaned therapie in buitenland!
o Ziekenhuizen die stamcelthrapie aanbieden die beweren alle patienten te knn genezen
MAAR gaat om stamceltherapie die niet via klinische studies en EMA is goedgekeurd
o Niet geregistreerd als gm en voldoen niet aan kwaliteit en claims! + kost patient veel
geld!
o Deze statement geeft aan hoe je dit kan herkennen en rapporteren
Insuline was eerste biotechnologisch gm dat op markt kwam
- Relatief klein EW bestaande uit 2 peptideketens
- Nu gebruik van biologische cellen, bacterien om insuline aan te maken
-
|| vroeger had elk land expertise => 50j geleden is EMA ontstaan => moeilijke onderwerpen moeten daar
geregistreerd worden
M RNA
- Aangemaakt uit DNA => makkelijk aan te maken in labo via PCR (mRNA niet)
DUS mRNA maken via biotechnologie:
1. Start uit DNA-molecuul met coderende sequentie voor gewenste EW
2. Dit DNA heeft ook promotor-sequentie die door specifiek RNA-polymerase w herkend
3. Menging DNA + RNA-polymerase en nucleotiden (NTP’s of ‘bouwstenen’)
4. Complementaire RNA-kopie kan ‘overgeschreven’ worden
- DNA kan men modificeren zodat men iets kan produceren dat normaal niet aangemaakt wordt
REGULATOIR: COMPLEXE PRODUCTEN
- Verplichte centrale route: alle biotech producten moeten via centrale route registreren
o Bv insuline: kan op biotechnologische manier gemaakt worden (niet altijd maar owv
indicatie toch deze route)
o Bv. antilichamen, mRNA-vaccins, kankertherapie, virale ziektes,…
- Bestaan ook guidelines
o active substance (drug substance) = actieve molecule van gm bv insuline
o finished product = eindproduct dat in de apotheek te vinden is,, bevat dus ook
hulpstoffen enal
o EMA is onderdeel van ICH (globaal) => ICH guidelines staan boven deze van EMA maar
die van EMA zijn natuurlijk op deze van ICH gebasseerd met mogelijk additieven
2. EIWITTEN EN TRANSLATIE
I. EIWITSYNTHESE
Prokaryoten: zie cursus bachelor
Eukaryoten: zie cursus bachelor
SIGNAAL SEQUENTIE EN PTM
PTM = post translationele modificaties = modificaties die na translatie zijn aangebracht
- Glycosylatie = specifieke vorm van PTM, waarbij suikergroepen (glycanen) aan een eiwit worden
gekoppeld
o Meeste EW zijn glycoproteïnen => hebben biologische relevantie
▪ Bv. stabiliteit (bescherming tegen proteasen), herkenning (bloed ABO),
transport, immuunsysteem…
, o Zijn niet gecodeerd in DNA => worden achteraf toegevoegd
o Glycoproteïne bevat
▪ #glycosylaties op één EW
▪ #glycosylaties mogelijk op eenzelfde AZ sequentie backbone => # effect op
biologische activiteit EW
▪ Veel glycoproteinen bevatten >50% suikers
1. Start van translatie (links)
- ribosoom begint met aflezen van
mRNA (groene lijn).
- Helemaal vooraan zit
signaalsequentie (blauw stukje
peptide) => geeft aan dat dit eiwit
naar endoplasmatisch reticulum
(ER) moet
2. Herkenning door SRP
- Signal Recognition Particle (SRP)
bindt signaalsequentie en brengt
het ribosoom naar de SRP-
receptor in het ER-membraan.
3. Translocatie in het ER
- ribosoom wordt gekoppeld aan een kanaal in ER-membraan en duwt groeiende eiwit het ER-
lumen in terwijl translatie doorgaat.
- signaalsequentie wordt meestal afgeknipt.
4. Glycosylering in het ER
- In het ER wordt een eerste suikerketen (glycan) toegevoegd: de "common core structure"
(GlcNAc + mannose).
- Dit is het begin van de N-glycosylering (suikers aan asparagine).
5. Verdere modificatie in Golgi (onderste deel van figuur)
- Het eiwit gaat van het ER naar het Golgi-apparaat.
- Daar worden extra suikers toegevoegd of verwijderd → zo ontstaan complexe glycans (met
galactose, fucose, siaalzuur).
- Dit bepaalt de uiteindelijke structuur en functie van het glycoproteïne.
O/N-LINKED
2 vormen glycosylatie:
- N-linked
o Begint in ER, verdere verwerking in golgi-apparaat
o Suikergroep vastgemaakt aan N-atoom van AZ asparagine in motief Asn–X–Ser/Thr (X =
elk aminozuur behalve proline)
o Eerst wordt ‘common core oligosacharide’ toegevoegd in ER
o Kan meer suikerresiduen koppelen (trimming en branching) dan O-linked => meer
ingewikkeld
o Knn # ‘antennes’ voorkomen:
▪ High
▪ Hybride
▪ complex
- O-linked
o In golgi-apparaat
o Suikergroep vastgemaakt aan hydroxylgroep van serine of threonine
, o Geen vaste ‘core’ zoals bij N-linked
o Zijn maar 2-3 suikerresiduen => veel eenvoudiger en minder impact op biologische
activiteit dan N-linked
! glycosylatie kan niet in bacterien uitgevoerd worden,, insuline is niet geglycolyseerd dus dit kan wel in
bacterien geproduceerd worden
ANDERE PTM
- Disulfide binding
o Bv covalente disulfidebinding tss 2 korte peptideketens in insuline
o Kan niet natuurlijk op zelfde manier aangemaakt worden door bacterien
- Glycosilatie: zie eerder
o ±70% van biotech gm (incl. mAb) zijn glycoproteïnen
- Fosforylatie
o Minder belangrijk voor gm => zijn instabiel
o Wel belangrijk biologisch bij signaaltransductiepathways
- Sulfatatie
o Biologisch van belang maar niet bij gm
o Bacterie kan deze enkel uitvoeren in periplasmatische ruimte => modificatie
(engineering) hier mogelijk
o Bij eukaryoten door oxidatieve eznymatische stappen in ER
o Tyrosinesulfatatie door TPST (tyrosylproteïnesulfotransferase) in golgi-apparaat => enkel
mogelijk door dieren en planten (niet bacterien en gisten)
|| Signaaltransductie en transcriptie
• Signaaltransductie = communicatie van buiten naar binnen de cel.
• Door receptoractivatie worden specifieke transcriptiefactoren geactiveerd.
• Die transcriptiefactoren binden aan bepaalde promotors → genen worden aan/uit gezet.
GLYCOSILATIE
Gisten:
- Knn glycosileren maar hebben niet dezelfde enzymen als mens
- Kan enkel high mannose vormen (meer dan bij de mens) =
antigeen
- Mogelijk biologisch probleem => immunogeen
(lichaamsvreemd -> antilichaamvorming) => vermijden!
Insecten:
- Hebben core wel maar geen vertakking
Planten:
- Hebben core en beetje vertakkingen maar nog niet zoals bij de
mens
Bacteriën:
- Geen maar kan wel ge-engeneerd worden
Niet-menselijke zoogdieren:
- Lijken goed op deze van mens maar nog niet hetzelfde
o Soms problematisch DUS maar beperkte soort zoogdiercellen gebruiken die toevallig
o mutaties hebben in enzymen die glycosilaties uitvoeren die lijken op die van de mens
o Bij niet-menselijke zoogdieren ontbreken de onderste rode symbolen en zijn er bovenaan
extra symbolen naast de paarse
- Kunnen als enige gebruikt worden voor gm
PROTEÏNEGENEESMIDDELEN
1. INLEIDING
BIOLOGISCHE GENEESMIDDELEN = BIOLOGICAL?
= gm gemaakt uit levende organismen (zoals bacteriën, gist, dierlijke of menselijke cellen)
= biologics = biopharmaceuticals???
Manier van produceren (biologische wijze) bepaalt of het een biological is
Synthetische aanmaak => GEEN biologic!
Bloed- en plasmaproducten:
= gm gemaakt dmv bloed van mens
- Bloedtransfusie is geen gm! TENZIJ er aanzienlijke bewerkingen gebeuren
o Bv 'fresh-frozen plasma’ = plasma dat uit donorbloed gehaald en ingevroren is, zodat het
later kan worden toegediend
Wel regelgeving als gm nodig
- EW opgezuiverd uit bloed
o Bv. albumine, immunoglobuline, …
o Geldt uitzonderlijke regelgeving voor
o Mogelijke gevaren die niet bij synthetische wijze voorkomen
▪ Bv virusinfecties bij persoon die bloed doneert
▪ Bij donatie moet hele vragenlijst ingevuld worden om risico’s in te schatten
o Belangrijkste productiestap: opzuivering
▪ Zorgen dat potentiële virale contaminanten uit bloed w gezuiverd
Biotech alternatives of biotechnologische gm
= EW die via recombinant DNA technologie worden aangemaakt
- Kleiner risico op contaminatie virussen MAAR groter risico contaminatie bacteriën
- Doel: EW laten produceren door cellen die van nature dit EW niet (knn) aanmaken -> manipulatie
- Bv. recombinante EW (bv insuline), monoklonale antilichamen (mAb), fusie-EW
Vaccins
- Biotechnologisch bv coronavaccin
- Kunnen ook niet biotechnologisch aangemaakt worden; klassieke oudere vaccins bv
influenzavaccin
o Virus w opgekweekt in kippeneieren en zo vermenigvuldigd en opgezuiverd, dan virus
verzwakken en toedienen => biologisch maar niet biotechnologisch
- Bespreking in cursus immunologie
ATMPs
= geavanceerde therapie-gm
- Gebaseerd op genen, weefsels of cellen
- Bv. cel en gentherapie, tissue engineered gm, CAR-T celtherapie, mRNA
o CAR-T celtherapie = behandeling waarbij eigen afweercellen (T-cellen) van patiënt
worden aangepast zodat ze kankercellen beter kunnen herkennen en vernietigen
o Tissue engineerd gm = organen die in bedrijf geproduceerd worden bv beenmerg
(stamcellen), hart, lever…
, o mRNA-vaccins: worden op relatief eenvoudige manier geproduceerd dus classificatie
ATMP is discussieerbaar
- opletten voor statement on unregulated advaned therapie in buitenland!
o Ziekenhuizen die stamcelthrapie aanbieden die beweren alle patienten te knn genezen
MAAR gaat om stamceltherapie die niet via klinische studies en EMA is goedgekeurd
o Niet geregistreerd als gm en voldoen niet aan kwaliteit en claims! + kost patient veel
geld!
o Deze statement geeft aan hoe je dit kan herkennen en rapporteren
Insuline was eerste biotechnologisch gm dat op markt kwam
- Relatief klein EW bestaande uit 2 peptideketens
- Nu gebruik van biologische cellen, bacterien om insuline aan te maken
-
|| vroeger had elk land expertise => 50j geleden is EMA ontstaan => moeilijke onderwerpen moeten daar
geregistreerd worden
M RNA
- Aangemaakt uit DNA => makkelijk aan te maken in labo via PCR (mRNA niet)
DUS mRNA maken via biotechnologie:
1. Start uit DNA-molecuul met coderende sequentie voor gewenste EW
2. Dit DNA heeft ook promotor-sequentie die door specifiek RNA-polymerase w herkend
3. Menging DNA + RNA-polymerase en nucleotiden (NTP’s of ‘bouwstenen’)
4. Complementaire RNA-kopie kan ‘overgeschreven’ worden
- DNA kan men modificeren zodat men iets kan produceren dat normaal niet aangemaakt wordt
REGULATOIR: COMPLEXE PRODUCTEN
- Verplichte centrale route: alle biotech producten moeten via centrale route registreren
o Bv insuline: kan op biotechnologische manier gemaakt worden (niet altijd maar owv
indicatie toch deze route)
o Bv. antilichamen, mRNA-vaccins, kankertherapie, virale ziektes,…
- Bestaan ook guidelines
o active substance (drug substance) = actieve molecule van gm bv insuline
o finished product = eindproduct dat in de apotheek te vinden is,, bevat dus ook
hulpstoffen enal
o EMA is onderdeel van ICH (globaal) => ICH guidelines staan boven deze van EMA maar
die van EMA zijn natuurlijk op deze van ICH gebasseerd met mogelijk additieven
2. EIWITTEN EN TRANSLATIE
I. EIWITSYNTHESE
Prokaryoten: zie cursus bachelor
Eukaryoten: zie cursus bachelor
SIGNAAL SEQUENTIE EN PTM
PTM = post translationele modificaties = modificaties die na translatie zijn aangebracht
- Glycosylatie = specifieke vorm van PTM, waarbij suikergroepen (glycanen) aan een eiwit worden
gekoppeld
o Meeste EW zijn glycoproteïnen => hebben biologische relevantie
▪ Bv. stabiliteit (bescherming tegen proteasen), herkenning (bloed ABO),
transport, immuunsysteem…
, o Zijn niet gecodeerd in DNA => worden achteraf toegevoegd
o Glycoproteïne bevat
▪ #glycosylaties op één EW
▪ #glycosylaties mogelijk op eenzelfde AZ sequentie backbone => # effect op
biologische activiteit EW
▪ Veel glycoproteinen bevatten >50% suikers
1. Start van translatie (links)
- ribosoom begint met aflezen van
mRNA (groene lijn).
- Helemaal vooraan zit
signaalsequentie (blauw stukje
peptide) => geeft aan dat dit eiwit
naar endoplasmatisch reticulum
(ER) moet
2. Herkenning door SRP
- Signal Recognition Particle (SRP)
bindt signaalsequentie en brengt
het ribosoom naar de SRP-
receptor in het ER-membraan.
3. Translocatie in het ER
- ribosoom wordt gekoppeld aan een kanaal in ER-membraan en duwt groeiende eiwit het ER-
lumen in terwijl translatie doorgaat.
- signaalsequentie wordt meestal afgeknipt.
4. Glycosylering in het ER
- In het ER wordt een eerste suikerketen (glycan) toegevoegd: de "common core structure"
(GlcNAc + mannose).
- Dit is het begin van de N-glycosylering (suikers aan asparagine).
5. Verdere modificatie in Golgi (onderste deel van figuur)
- Het eiwit gaat van het ER naar het Golgi-apparaat.
- Daar worden extra suikers toegevoegd of verwijderd → zo ontstaan complexe glycans (met
galactose, fucose, siaalzuur).
- Dit bepaalt de uiteindelijke structuur en functie van het glycoproteïne.
O/N-LINKED
2 vormen glycosylatie:
- N-linked
o Begint in ER, verdere verwerking in golgi-apparaat
o Suikergroep vastgemaakt aan N-atoom van AZ asparagine in motief Asn–X–Ser/Thr (X =
elk aminozuur behalve proline)
o Eerst wordt ‘common core oligosacharide’ toegevoegd in ER
o Kan meer suikerresiduen koppelen (trimming en branching) dan O-linked => meer
ingewikkeld
o Knn # ‘antennes’ voorkomen:
▪ High
▪ Hybride
▪ complex
- O-linked
o In golgi-apparaat
o Suikergroep vastgemaakt aan hydroxylgroep van serine of threonine
, o Geen vaste ‘core’ zoals bij N-linked
o Zijn maar 2-3 suikerresiduen => veel eenvoudiger en minder impact op biologische
activiteit dan N-linked
! glycosylatie kan niet in bacterien uitgevoerd worden,, insuline is niet geglycolyseerd dus dit kan wel in
bacterien geproduceerd worden
ANDERE PTM
- Disulfide binding
o Bv covalente disulfidebinding tss 2 korte peptideketens in insuline
o Kan niet natuurlijk op zelfde manier aangemaakt worden door bacterien
- Glycosilatie: zie eerder
o ±70% van biotech gm (incl. mAb) zijn glycoproteïnen
- Fosforylatie
o Minder belangrijk voor gm => zijn instabiel
o Wel belangrijk biologisch bij signaaltransductiepathways
- Sulfatatie
o Biologisch van belang maar niet bij gm
o Bacterie kan deze enkel uitvoeren in periplasmatische ruimte => modificatie
(engineering) hier mogelijk
o Bij eukaryoten door oxidatieve eznymatische stappen in ER
o Tyrosinesulfatatie door TPST (tyrosylproteïnesulfotransferase) in golgi-apparaat => enkel
mogelijk door dieren en planten (niet bacterien en gisten)
|| Signaaltransductie en transcriptie
• Signaaltransductie = communicatie van buiten naar binnen de cel.
• Door receptoractivatie worden specifieke transcriptiefactoren geactiveerd.
• Die transcriptiefactoren binden aan bepaalde promotors → genen worden aan/uit gezet.
GLYCOSILATIE
Gisten:
- Knn glycosileren maar hebben niet dezelfde enzymen als mens
- Kan enkel high mannose vormen (meer dan bij de mens) =
antigeen
- Mogelijk biologisch probleem => immunogeen
(lichaamsvreemd -> antilichaamvorming) => vermijden!
Insecten:
- Hebben core wel maar geen vertakking
Planten:
- Hebben core en beetje vertakkingen maar nog niet zoals bij de
mens
Bacteriën:
- Geen maar kan wel ge-engeneerd worden
Niet-menselijke zoogdieren:
- Lijken goed op deze van mens maar nog niet hetzelfde
o Soms problematisch DUS maar beperkte soort zoogdiercellen gebruiken die toevallig
o mutaties hebben in enzymen die glycosilaties uitvoeren die lijken op die van de mens
o Bij niet-menselijke zoogdieren ontbreken de onderste rode symbolen en zijn er bovenaan
extra symbolen naast de paarse
- Kunnen als enige gebruikt worden voor gm
