, 3.2 RNA
DNA vs. RNA
1. RNA: Ribose (2’ OH) vs. DNA: Desoxyribose (2’H)
=> RNA onstabiel: makkelijk afbraak door RNAse (moeilijker bestuderen)
want doel RNA = instabiel zijn = tijdelijke boodschap dus snelle afbraak nodig.
RNA heeft een 2’OH, dit is heel vatbaar voor afbraak door RNAsen
=> doel DNA = stabiel zijn = genoom => moet intact blijven
2. RNA: uracil vs. DNA: thymine
3. RNA: enkelstrengige vs. DNA: dubbelstrengig (basenparen)
4. DNA = Humane genoom = ~20.000 genen
5. RNA = Humane transcriptoom = complexer = ~200.000 transcripten (precieze aantal is
nog onzeker)
a. 50-100 000 proteïne coderend
b. Vele niet coderend (lncRNA, microRNA,…), pseudogenen, artefacten
c. Gen -> vaak meerdere transcripten door alternatieve splicing
Soorten RNA:
- coderend en niet-coderend
- mRNA: 1-4% van totaal RNA, meestal poly-A staart, Coderend voor eiwitten
- rRNA: 80-95% van totaal RNA
- short ncRNAs: kort = <200 nt
- lncRNAs: lang = >200 nt, > 16000 gekend
, Methoden 2: 2.3 RNA
- RNA voorzorgen en bewaren (instabiel RNA)
- RNA extraheren
- RNA kwantificeren
- RNA concentreren
- RNA in vitro aanmaken
- RNA reverse transcriptie
- RNA analyseren
- Voorbeeld toepassing: Covid-19 diagnostische
testen
HERHALING
1. Northern blotting
We brengen dit over op een membraan om dit gemakkelijker
te kunnen hybridiseren met een probe en dan een transcript te
gaan aankleuren.
Staal => RNA extractie => elektroforese: RNA op gel zetten => transfer naar membraan:
- probe kan makkelijker bij RNA (<> probe diffusie in gel diffunderen)
- achtergrond makkelijk wegwassen
=> detectie bep. transcript: bekijk grootte bandje, splice varianten, …
Northern blotting = voor RNA
Southern blotting = voor DNA
Western blotting = voor eiwitten
, 2. Kwantitatieve PCR:
→ Real-time PCR = quantitative PCR = RT-PCR / qPCR
→ Droplet digital PCR = ddPCR
<>Klassieke PCR: 1e # PCR-cycli, dan op gel zetten => eindpunt detectie
= kwalitatief & semi-kwantitatief
Kwantitatieve PCR: qPCR = RT-PCR = real time detectie
=> na elke cyclus fluorescentie bekijken => curve maken
=> curves van elk staal vergelijken o.b.v. Ct scores => relatieve
kwantificatie (vgl. 2 stalen) nadeel: fluorescent signaal => heel lage
expressie & hoge expressie niet zo kwantitatief
Droplet digital PCR = ddPCR = eindpuntdetectie
=> staal verdunnen: verspreid over putjes => 1 of GEEN fragment per putje
=> PCR => zie welk putje positief (frag in putjes), welk negatief (geen frag)
= digitaal: positief of negatief => zeer kwantitatief (<> fluo signaal) => absolute kwantificatie
TRANSCRIPTOMICS
=> 2 grote methoden: RNA-micro-arrays en RNA sequencing
Microarray is een gesloten systeem omdat we enkel een probe hebben voor de arrays dat
we willen bekijken en enkel die arrays kunnen we gaan bekijken.
RNA sequencing is een open systeem; RNA wordt omgezet naar cDNA en daar kunnen
sequencing instaan die we nooit in de arrays hadden kunnen zetten
=> Voor- en nadelen
=> Maar wanneer welke methoden gebruiken?
- weinig transcripten/genen bekijken => qPCR (goedkoop)
DNA vs. RNA
1. RNA: Ribose (2’ OH) vs. DNA: Desoxyribose (2’H)
=> RNA onstabiel: makkelijk afbraak door RNAse (moeilijker bestuderen)
want doel RNA = instabiel zijn = tijdelijke boodschap dus snelle afbraak nodig.
RNA heeft een 2’OH, dit is heel vatbaar voor afbraak door RNAsen
=> doel DNA = stabiel zijn = genoom => moet intact blijven
2. RNA: uracil vs. DNA: thymine
3. RNA: enkelstrengige vs. DNA: dubbelstrengig (basenparen)
4. DNA = Humane genoom = ~20.000 genen
5. RNA = Humane transcriptoom = complexer = ~200.000 transcripten (precieze aantal is
nog onzeker)
a. 50-100 000 proteïne coderend
b. Vele niet coderend (lncRNA, microRNA,…), pseudogenen, artefacten
c. Gen -> vaak meerdere transcripten door alternatieve splicing
Soorten RNA:
- coderend en niet-coderend
- mRNA: 1-4% van totaal RNA, meestal poly-A staart, Coderend voor eiwitten
- rRNA: 80-95% van totaal RNA
- short ncRNAs: kort = <200 nt
- lncRNAs: lang = >200 nt, > 16000 gekend
, Methoden 2: 2.3 RNA
- RNA voorzorgen en bewaren (instabiel RNA)
- RNA extraheren
- RNA kwantificeren
- RNA concentreren
- RNA in vitro aanmaken
- RNA reverse transcriptie
- RNA analyseren
- Voorbeeld toepassing: Covid-19 diagnostische
testen
HERHALING
1. Northern blotting
We brengen dit over op een membraan om dit gemakkelijker
te kunnen hybridiseren met een probe en dan een transcript te
gaan aankleuren.
Staal => RNA extractie => elektroforese: RNA op gel zetten => transfer naar membraan:
- probe kan makkelijker bij RNA (<> probe diffusie in gel diffunderen)
- achtergrond makkelijk wegwassen
=> detectie bep. transcript: bekijk grootte bandje, splice varianten, …
Northern blotting = voor RNA
Southern blotting = voor DNA
Western blotting = voor eiwitten
, 2. Kwantitatieve PCR:
→ Real-time PCR = quantitative PCR = RT-PCR / qPCR
→ Droplet digital PCR = ddPCR
<>Klassieke PCR: 1e # PCR-cycli, dan op gel zetten => eindpunt detectie
= kwalitatief & semi-kwantitatief
Kwantitatieve PCR: qPCR = RT-PCR = real time detectie
=> na elke cyclus fluorescentie bekijken => curve maken
=> curves van elk staal vergelijken o.b.v. Ct scores => relatieve
kwantificatie (vgl. 2 stalen) nadeel: fluorescent signaal => heel lage
expressie & hoge expressie niet zo kwantitatief
Droplet digital PCR = ddPCR = eindpuntdetectie
=> staal verdunnen: verspreid over putjes => 1 of GEEN fragment per putje
=> PCR => zie welk putje positief (frag in putjes), welk negatief (geen frag)
= digitaal: positief of negatief => zeer kwantitatief (<> fluo signaal) => absolute kwantificatie
TRANSCRIPTOMICS
=> 2 grote methoden: RNA-micro-arrays en RNA sequencing
Microarray is een gesloten systeem omdat we enkel een probe hebben voor de arrays dat
we willen bekijken en enkel die arrays kunnen we gaan bekijken.
RNA sequencing is een open systeem; RNA wordt omgezet naar cDNA en daar kunnen
sequencing instaan die we nooit in de arrays hadden kunnen zetten
=> Voor- en nadelen
=> Maar wanneer welke methoden gebruiken?
- weinig transcripten/genen bekijken => qPCR (goedkoop)
