HOOFDSTUK 1: HISTOLOGISCHE TECHNIEKEN
Algemeen
Histologie = studie van de microscopische structuur van weefsels
Cytologie = studie van cellen
Organisatieniveaus: supramacroscopisch (pupulatie) > macroscopisch (organisme) > microscopisch (cel) >
submicroscopisch (celorganel) > moleculair (molecule)
cel weefsel orgaan orgaanstelsel organisme
Weefselbewerking (voor microscopie)
Doel: weefsels en organen observeerbaar maken voor lichtmicroscopie en elektronenmicroscopie
Problemen: weinig contrast, alles heeft ongeveer dezelfde kleur + weinig licht/elektronen doorlatend
Oplossing: weefselbewerking (verloopt in 4 stappen)
STAP 1: fixeren
Doel: - weefselstructuur bewaren en afbraak stoppen (door eiwitdenaturatie = vorm van enzymen
veranderen waardoor geen afbreekreactie meer optreedt = inactivatie van enzymen)
- permeabiliseren van celmembraan
- weefsel harder en poreuzer maken
Methoden: - chemische fixatie door immersie (onderdompelen in fixatief) of perfusie (fixatief inbrengen
via bloedvatenstelsel) van het weefsel
- koude fixatie door invriezen van weefsel (vorming van vriescoupes)
Artefacten = onbedoelde veranderingen in weefsel door fixatie/inbedding (vb. lacunes in kraakbeen) (! lacunes
in bot zijn geen artefacten)
STAP 2: inbedden
Doel: - weefsel doordringen met inbedmiddel (para ine voor lichtmicroscoop,
harsen, plastics voor licht- en elektronenmicroscoop), na indringing wordt deze substantie
hard en wordt het materiaal snijdbaar (= coupes)
Probleem: inbedmiddelen zijn hydrofoob (stoten water af), weefsels zijn waterig
Oplossing: weefsel ontwateren in alcoholbaden (30% - 100%) en clearing in tolueen (eigenschap: oplosbaar in
alcohol en oplosbaar in para ine)
Trimming = bijsnijden van gefixeerd weefsel zodat alleen het relevante deel van het weefsel behouden wordt
met ‘zo weinig mogelijk’ inbedmiddel
STAP 3: snijden
Doel: - snijden van weefsel in zo dun mogelijke coupes (hoe harder het inbedmiddel, hoe dunner de
coupes)
Methode: - para inecoupes: microtoom met stalen mes ~ 5 μm (LM)
- harsen- en plasticscoupes: microtoom met glazen/diamanten mes ~ 50nm - 2 μm (LM) en
70 nm (EL)
,STAP 4: kleuren (LM) of contrasteren (EM)
KLEUREN (lichtmicroscopie):
Opm. lichtmicroscopische beelden bevatten verschillende kleuren
Doel: contrast geven aan cellen en structuren (met zure, basische en indi erente kleursto en)
Kleursto en bestaan uit 2 componenten: chromofoor (= eigenlijke kleurdrager) en auxochroom (hydrofiel
gedeelte, maakt kleurstof wateroplosbaar en bindt chromofoor aan weefsel)
De pH van het kleurmilieu beïnvloedt de lading van weefselcomponenten, het iso-elektrisch punt (IEP) is de
pH waarbij een eiwit geen elektrische lading heeft, onder het IEP: binden met zure kleursto en; boven het IEP:
binden met basische kleursto en
Probleem: kleursto en zijn waterige oplossingen, coupes zijn hydrofoob
Oplossing: coupes depara ineren met tolueen
1. Hematoxyline-eosine kleuring = HE-kleuring: - Hematoxyline (blauwkleurig) = basische kleurstof
(positief geladen, kationisch) kleurt zure structuren
(OH-) = basofiel
- Eosine (rooskleurig) = zure kleurstof (negatief
geladen, anionisch) kleurt basische structuren (H+)
= eosinofiel
Structuren die ‘slecht’ visualiseerbaar zijn met HE-kleuring:
Sachariden (koolhydraten):
Kleurbaar met kationische, basische kleursto en
Problemen: vaak gebonden met andere moleculen, slecht kleurbaar met HE-kleuring,
metachromatische kleuren
Lipiden (vetten):
Hydrofoob (C-keten) en hydrofiel (-COOH)
Problemen: lossen op in alcohol
Oplossing: gebruik van vriescoupes met Soudan black, bij EM: gebruik van OsO4, bindt aan
vetzuurketens en membranen worden zichtbaar
2. Period acid-schi kleuring = PAS-kleuring: - zichtbaar maken van polysachariden en
glycoproteïnen, lipiden of mucines (slijmsto en)
- Periodinezuur oxideert bepaalde suikergroepen tot
aldehyden, Schi -reagens bindt aan deze aldehyden
paars/roze kleur
3. Feulgen kleuring: - Zichtbaar maken van DNA
- Zuur hydrolyse breekt deoxyribose in DNA af,
waardoor aldehydegroepen vrijkomen, Schi -
reagens bindt aan deze aldehyden paars/roze kleur
4. Enzymhistochemie: - Enzymactiviteit in weefsels zichtbaar maken
- Toevoegen van substraat (vb. DAB) waarmee het
enzym reageert en er neerslag wordt gevormd
donkere kleur
, 5. Autoradiografie: - Metabole activiteit zichtbaar maken (vb. DNA/RNA
synthese)
- Weefsels of cellen worden blootgesteld aan een
radioactieve stof, de radioactieve straling
veroorzaakt belichting van de emulsie zwarte korrel
6. Immunohistochemie (IHC)*: - Specifieke eiwitten of specifieke molecule aantonen
- Antistof/antilichaam (vaak gekoppeld aan enzym of
fluorochroom) bindt aan de doel-molecule,
toevoegen van een substraat zorgt voor gekleurde
precipitaat of fluorescerend signaal
- Indirecte en directe IHC
7. In situ hybridisatie (ISH)*: - Specifieke nucleïnezuursequenties (DNA of RNA)
aantonen
- Een gelabelde nucleïnezuurprobe wordt ingebracht,
hybridiseert zich aan de complementaire sequentie,
label wordt zichtbaar
* gebruik van fluormicroscopie: het weefsel wordt gekleurd met fluorochromen die zich binden aan specifieke
structuren, de fluorchromen absorberen licht en zenden licht uit op een langere golflengte (fluorescentie)
Metachromasie = kleurverandering van een kleurstof wanneer die bindt aan bepaalde weefselstructuren, de
kleur wordt anders dan die van de oorspronkelijke kleurstofoplossing door aggregatie van kleurstofmoleculen in
structuren met zeer veel zure groepen
CONTRASTEREN (elektronenmicroscopie):
Opm. elektronenmicroscopische beelden zijn zwart-wit
Doel: contrast geven aan cellen, celbestanddelen en extracellulair materiaal (met contrastvloeisto en)
Contrastvloeisto en = sto en die zware metalen bevatten (U, Pb, Os…) waardoor er meer elektronen
verstrooien of geabsorbeerd worden, zodat structuren beter zichtbaar worden
TEM (transmission electron microscopy) = elektronenmicroscopie waarbij een bundel elektronen door een
preparaat heen worden gestuurd
SEM (scanning electron microscopy) = elektronenmicroscopie waarbij elektronen over het oppervlak van een
preparaat worden gescand
Observatiemethoden
Lichtmicroscopie: gebruik van zichtbaar licht en lenzen om weefsels en cellen te bekijken (maximale
vergroting: 1000x) (resolutievermogen: 250 nm)
Elektronenmicroscopie: gebruik van elektronenbundels met korte golflengte waardoor hogere resolutie
mogelijk is (vergroting > 100.000x) (resolutievermogen: 2-3 nm, nieuwere modellen tot 0,1 nm)
Virtuele microscopie: digitale microscopie waarbij coupes worden gescand
Algemeen
Histologie = studie van de microscopische structuur van weefsels
Cytologie = studie van cellen
Organisatieniveaus: supramacroscopisch (pupulatie) > macroscopisch (organisme) > microscopisch (cel) >
submicroscopisch (celorganel) > moleculair (molecule)
cel weefsel orgaan orgaanstelsel organisme
Weefselbewerking (voor microscopie)
Doel: weefsels en organen observeerbaar maken voor lichtmicroscopie en elektronenmicroscopie
Problemen: weinig contrast, alles heeft ongeveer dezelfde kleur + weinig licht/elektronen doorlatend
Oplossing: weefselbewerking (verloopt in 4 stappen)
STAP 1: fixeren
Doel: - weefselstructuur bewaren en afbraak stoppen (door eiwitdenaturatie = vorm van enzymen
veranderen waardoor geen afbreekreactie meer optreedt = inactivatie van enzymen)
- permeabiliseren van celmembraan
- weefsel harder en poreuzer maken
Methoden: - chemische fixatie door immersie (onderdompelen in fixatief) of perfusie (fixatief inbrengen
via bloedvatenstelsel) van het weefsel
- koude fixatie door invriezen van weefsel (vorming van vriescoupes)
Artefacten = onbedoelde veranderingen in weefsel door fixatie/inbedding (vb. lacunes in kraakbeen) (! lacunes
in bot zijn geen artefacten)
STAP 2: inbedden
Doel: - weefsel doordringen met inbedmiddel (para ine voor lichtmicroscoop,
harsen, plastics voor licht- en elektronenmicroscoop), na indringing wordt deze substantie
hard en wordt het materiaal snijdbaar (= coupes)
Probleem: inbedmiddelen zijn hydrofoob (stoten water af), weefsels zijn waterig
Oplossing: weefsel ontwateren in alcoholbaden (30% - 100%) en clearing in tolueen (eigenschap: oplosbaar in
alcohol en oplosbaar in para ine)
Trimming = bijsnijden van gefixeerd weefsel zodat alleen het relevante deel van het weefsel behouden wordt
met ‘zo weinig mogelijk’ inbedmiddel
STAP 3: snijden
Doel: - snijden van weefsel in zo dun mogelijke coupes (hoe harder het inbedmiddel, hoe dunner de
coupes)
Methode: - para inecoupes: microtoom met stalen mes ~ 5 μm (LM)
- harsen- en plasticscoupes: microtoom met glazen/diamanten mes ~ 50nm - 2 μm (LM) en
70 nm (EL)
,STAP 4: kleuren (LM) of contrasteren (EM)
KLEUREN (lichtmicroscopie):
Opm. lichtmicroscopische beelden bevatten verschillende kleuren
Doel: contrast geven aan cellen en structuren (met zure, basische en indi erente kleursto en)
Kleursto en bestaan uit 2 componenten: chromofoor (= eigenlijke kleurdrager) en auxochroom (hydrofiel
gedeelte, maakt kleurstof wateroplosbaar en bindt chromofoor aan weefsel)
De pH van het kleurmilieu beïnvloedt de lading van weefselcomponenten, het iso-elektrisch punt (IEP) is de
pH waarbij een eiwit geen elektrische lading heeft, onder het IEP: binden met zure kleursto en; boven het IEP:
binden met basische kleursto en
Probleem: kleursto en zijn waterige oplossingen, coupes zijn hydrofoob
Oplossing: coupes depara ineren met tolueen
1. Hematoxyline-eosine kleuring = HE-kleuring: - Hematoxyline (blauwkleurig) = basische kleurstof
(positief geladen, kationisch) kleurt zure structuren
(OH-) = basofiel
- Eosine (rooskleurig) = zure kleurstof (negatief
geladen, anionisch) kleurt basische structuren (H+)
= eosinofiel
Structuren die ‘slecht’ visualiseerbaar zijn met HE-kleuring:
Sachariden (koolhydraten):
Kleurbaar met kationische, basische kleursto en
Problemen: vaak gebonden met andere moleculen, slecht kleurbaar met HE-kleuring,
metachromatische kleuren
Lipiden (vetten):
Hydrofoob (C-keten) en hydrofiel (-COOH)
Problemen: lossen op in alcohol
Oplossing: gebruik van vriescoupes met Soudan black, bij EM: gebruik van OsO4, bindt aan
vetzuurketens en membranen worden zichtbaar
2. Period acid-schi kleuring = PAS-kleuring: - zichtbaar maken van polysachariden en
glycoproteïnen, lipiden of mucines (slijmsto en)
- Periodinezuur oxideert bepaalde suikergroepen tot
aldehyden, Schi -reagens bindt aan deze aldehyden
paars/roze kleur
3. Feulgen kleuring: - Zichtbaar maken van DNA
- Zuur hydrolyse breekt deoxyribose in DNA af,
waardoor aldehydegroepen vrijkomen, Schi -
reagens bindt aan deze aldehyden paars/roze kleur
4. Enzymhistochemie: - Enzymactiviteit in weefsels zichtbaar maken
- Toevoegen van substraat (vb. DAB) waarmee het
enzym reageert en er neerslag wordt gevormd
donkere kleur
, 5. Autoradiografie: - Metabole activiteit zichtbaar maken (vb. DNA/RNA
synthese)
- Weefsels of cellen worden blootgesteld aan een
radioactieve stof, de radioactieve straling
veroorzaakt belichting van de emulsie zwarte korrel
6. Immunohistochemie (IHC)*: - Specifieke eiwitten of specifieke molecule aantonen
- Antistof/antilichaam (vaak gekoppeld aan enzym of
fluorochroom) bindt aan de doel-molecule,
toevoegen van een substraat zorgt voor gekleurde
precipitaat of fluorescerend signaal
- Indirecte en directe IHC
7. In situ hybridisatie (ISH)*: - Specifieke nucleïnezuursequenties (DNA of RNA)
aantonen
- Een gelabelde nucleïnezuurprobe wordt ingebracht,
hybridiseert zich aan de complementaire sequentie,
label wordt zichtbaar
* gebruik van fluormicroscopie: het weefsel wordt gekleurd met fluorochromen die zich binden aan specifieke
structuren, de fluorchromen absorberen licht en zenden licht uit op een langere golflengte (fluorescentie)
Metachromasie = kleurverandering van een kleurstof wanneer die bindt aan bepaalde weefselstructuren, de
kleur wordt anders dan die van de oorspronkelijke kleurstofoplossing door aggregatie van kleurstofmoleculen in
structuren met zeer veel zure groepen
CONTRASTEREN (elektronenmicroscopie):
Opm. elektronenmicroscopische beelden zijn zwart-wit
Doel: contrast geven aan cellen, celbestanddelen en extracellulair materiaal (met contrastvloeisto en)
Contrastvloeisto en = sto en die zware metalen bevatten (U, Pb, Os…) waardoor er meer elektronen
verstrooien of geabsorbeerd worden, zodat structuren beter zichtbaar worden
TEM (transmission electron microscopy) = elektronenmicroscopie waarbij een bundel elektronen door een
preparaat heen worden gestuurd
SEM (scanning electron microscopy) = elektronenmicroscopie waarbij elektronen over het oppervlak van een
preparaat worden gescand
Observatiemethoden
Lichtmicroscopie: gebruik van zichtbaar licht en lenzen om weefsels en cellen te bekijken (maximale
vergroting: 1000x) (resolutievermogen: 250 nm)
Elektronenmicroscopie: gebruik van elektronenbundels met korte golflengte waardoor hogere resolutie
mogelijk is (vergroting > 100.000x) (resolutievermogen: 2-3 nm, nieuwere modellen tot 0,1 nm)
Virtuele microscopie: digitale microscopie waarbij coupes worden gescand
