HOOFDSTUK 4 : GENTECHNOLOGIE
à Hoe kan je vanuit het fenotype het genotype achterhalen?
- Bv bij een bepaalde ziekte (fenotype) de oorzakelijke mutatie achterhalen (genotype)
DNA technieken
Kloneren van DNA-moleculen: schema
Ø Om dit te kunnen doen heb je natuurlijk DNA moleculen nodig
o Vaak wordt hier voor bloed gebruikt en dan de WBC
§ RBC hebben geen kern dus kan je op dit vlak niets mee doen
• Behalve bij konijnen en vogels
Ø Als eerste wordt de cel opengebroken à cellyse
o Zo komt het genomisch DNA vrij
Ø Dit genomsich DNA wordt geknipt à fragmentering
Ø Voor het kloneren heb je een vector nodig
o Deze staat in voor de amplificatie
Ø De gefragmenteerde DNA stukjes worden in de vector gestopt
o Dit noemt men ligatie
Ø Zo krijg je en recombinante molecule
Ø Deze wordt dan ingebracht in bv een bacterie à transformatie
1. DNA isolatie/zuivering
- Je hebt een bepaalde cel met genetisch materiaal
o Nu moet je dit materiaal eruit krijgen
o Dit gaat men doen door de cel open te breken = lyseren
§ Dit kan op veel verschillende manieren
- Wanneer de cel opengebroken is komt de volledige inhoud vrij
o Men moet dan het DNA scheiden van het overige celmateriaal
o Ook hier zijn veel verschillende methoden voor beschikbaar
- Je moet je ook afvragen hoe zuiver je dat DNA wil à kwaliteit
o Is natuurlijk afhankelijk van wat je er mee wil doen
- Nieuwe technieken laten toe dat zuivering en scheiding van het DNA niet meer nodig is!
Veel gebruikte methode:
Ø De cellen worden opengebroken met detergent
o Meestal is dit SDS
1
, § Dit maakt de celmembraan kapot waardoor de inhoud vrij komt
Ø Afbraak van eiwitten gebeurd door middel van proteïnase K
o De peptide stukjes kunnen verwijderd worden met fenol/chloroform extractie
Ø Eventueel kan je ook het RNA afbreken door midden van een RNase
o Dit is in de meeste gevallen niet nodig
2. DNA fragmentering
- Kan ook op verschillende manieren
o Mechanisch
§ Dit gebeurt meestal door ultrasonicatie
§ Hierbij worden ultrasone geluidsgolven doorheen het proefbuisjes gestuurd
waardoor het DNA breekt
§ DNA is een robuuste molecule
• Maar niet als je het in de lengte bekijkt
o Dan is het redelijk fragiel
o Zo als een haar
• In de breedte is het wel heel moeilijk om te breken
§ Nadeel van deze methode
• Het DNA breekt op een willekeurige plaats
o Je kan zelf niet beslissen/controleren waar het breekt
o Hierdoor heb je willekeurige uiteinden wat ligatie moeilijk kan
maken
§ Voordeel van deze methode
• De fragmenten die je krijgt zijn wel ongeveer van gelijke lengte
ð Deze methode wordt niet gebruikt wanneer men DNA wil kloneren maar wel voor genoom
sequencing
oEnzymatisch
§ Voordeel
• Je kan wel controleren waar er geknipt wordt
• Hierdoor heb je sequentiespecifieke uiteinden
o Waardoor ligatie makkelijker kan gebeuren
§ Nadeel
• De fragmentlengte is sterk verschillend
ð Voor DNA klonatie is dit iets wat wel regelmatig gebruikt wordt
Enzymatische methode uitgelegd
- Het knippen van de DNA moleculen zal gebeuren door endonucleasen
o Met name restrictie endonucleasen (RE)
§ Een groep van enzymes die bijna allemaal uit bacteriën – prokaryoten komen
• Eukaryoten hebben deze enzymes niet
• Voor bacteriën vormen deze een soort van immuniteit
§ Deze RE hebben een specifieke herkenningsplaats
• Binden op het DNA thv een specifiek motiefje
• Dit is vaak een palindroom sequentie
- Wat gaan ze doen
2
, o Ze maken fosfodiëster breuken in beide enkelstrengen
- Na het knippen heb je een
o Vrije 5’ fosfaat
o Vrije 3’ OH groep
o Zonder deze vrije groepen zou je geen ligatie kunnen doen, dus is vrij belangrijk
Palindromen
- Dit is zo een vaste herkenningsplaats voor een RE
- Je moet altijd 5’ 3’ kijken!
o Dus ook in de onderste streng!
- Er kan op 3 verschillende manieren worden geknipt
o Beide strengen worden geknipt tussen de G en A
§ Geknipt 1 base na het 5’ uiteinde
§ EcoRI
o Kan ook 1 base na het 3’ uiteinde
§ PST 1
o Er kan ook in het midden worden geknipt
§ Sma 1
ð Je krijgt hierbij dus ook 3 verschillende types uiteinden
è Bij EcoRI en PST 1 krijg je na het uiteinde enkelstrengige stukjes à deze noemen sticky
uiteinden
o Dit enkelstrengige stukje is complementair met het ander enkelstrengig stukje dus
je kan deze aan elkaar plakken
o Deze bij de EcoRi zijn 5’ overhangend
o Bij PST 1 is het 3’ overhangend
ð Je kan de sticky ends van EcoRi en PST 1 dus niet aan elkaar plakken
ð Je kan enkel 5’ overhangend – 5’ overhangend aan elkaar hangen en twee keer 3’ overhangen
è Bij Sma1 à blunt uiteinde
o Hierbij is er geen overhangend stukje
o Je kan deze ook niet zomaar terug aan elkaar plakken
RE: nomenclatuur
- De resitrictie endonucleasen zijn allemaal afkomstig vanuit bacteriën
- Hun naam zal dan ook afgeleid zijn van de bacteriespecies waaruit ze werden geïsoleerd
o Bv: EcoRI van Escherichia Coli
3
, RE: host restriction
- Functie
o Ze zijn enkel aanwezig in bacteriën en dienen als beschreming
o Ze zorgen voor een selectieve afbraak van vreemd DNA
- Er is natuurlijk een kans dat het motiefje van het vreemde DNA sterk lijkt op dat van het
eigen DNA
o Daarom zal het eigen DNA beschermd worden door specifieke methylatie thv de
RE herkenningsplaatsen
o Dit noemt men host restriction
o Deze methylering zal vnl op de adenines gebeuren
§ Dit is op een adenine dicht bij de knip plaats
§ Hierdoor zal er involdoende plaats zijn voor het restrictie enzyme
RE knipfrequentie
- Aantal herkenningsplaatsen
o 4, 6 of 8 bp
§ Wanneer je kleine fragementen wil dan
• Dan worden RE gebruikt met een motief van 4 nucleotiden
• Statisch gezien zal een groepje van 4 nucleotiden meer voorkomen in
het genoom dan in van 6 of 8
§ De meest gebruikte is echter deze van 6 bp
- Samenstelling herkenningsplaats
o Verhouding CG/GC
§ CG zal 1 keer op de 4 GC voorkomen
- Methylatiegraad en gevoeligheid
Scheiding van DNA-fragmenten: elektroforese
- Dit zorgt voor een scheiding op lengte
- 3 types
o Agarose elektroforese
§ Wordt het meeste gebruikt
§ Kan zorgen voor een scheiding van 50bp tot 40 000
§ Resolutie à 10bp
o Puled field gel elektroforese
§ Voor heel grote fragementen
§ Zorgt voor een scheiding van 5000bp tot 10Mbp
§ Resolutie à 5kbp
o Polyacrylamide elektroforese
§ Voor kleine fragmenten
§ Scheiding van 10bp tot 1000 bp
§ Resolutie à 1bp!
ð Deze hebben allemaal een bepaalde resolutie = scheidend vermogen
o Dit scheidend vermogen geeft weer op hoeveel bp je fragementen uit elkaar kan
halen
o Bv scheidend vermogen van 10 bp wil zeggen dat het een onderscheid kan maken
tussen een fragment met 80 en 90 bp maar niet tussen 80 en 83 bp
4
à Hoe kan je vanuit het fenotype het genotype achterhalen?
- Bv bij een bepaalde ziekte (fenotype) de oorzakelijke mutatie achterhalen (genotype)
DNA technieken
Kloneren van DNA-moleculen: schema
Ø Om dit te kunnen doen heb je natuurlijk DNA moleculen nodig
o Vaak wordt hier voor bloed gebruikt en dan de WBC
§ RBC hebben geen kern dus kan je op dit vlak niets mee doen
• Behalve bij konijnen en vogels
Ø Als eerste wordt de cel opengebroken à cellyse
o Zo komt het genomisch DNA vrij
Ø Dit genomsich DNA wordt geknipt à fragmentering
Ø Voor het kloneren heb je een vector nodig
o Deze staat in voor de amplificatie
Ø De gefragmenteerde DNA stukjes worden in de vector gestopt
o Dit noemt men ligatie
Ø Zo krijg je en recombinante molecule
Ø Deze wordt dan ingebracht in bv een bacterie à transformatie
1. DNA isolatie/zuivering
- Je hebt een bepaalde cel met genetisch materiaal
o Nu moet je dit materiaal eruit krijgen
o Dit gaat men doen door de cel open te breken = lyseren
§ Dit kan op veel verschillende manieren
- Wanneer de cel opengebroken is komt de volledige inhoud vrij
o Men moet dan het DNA scheiden van het overige celmateriaal
o Ook hier zijn veel verschillende methoden voor beschikbaar
- Je moet je ook afvragen hoe zuiver je dat DNA wil à kwaliteit
o Is natuurlijk afhankelijk van wat je er mee wil doen
- Nieuwe technieken laten toe dat zuivering en scheiding van het DNA niet meer nodig is!
Veel gebruikte methode:
Ø De cellen worden opengebroken met detergent
o Meestal is dit SDS
1
, § Dit maakt de celmembraan kapot waardoor de inhoud vrij komt
Ø Afbraak van eiwitten gebeurd door middel van proteïnase K
o De peptide stukjes kunnen verwijderd worden met fenol/chloroform extractie
Ø Eventueel kan je ook het RNA afbreken door midden van een RNase
o Dit is in de meeste gevallen niet nodig
2. DNA fragmentering
- Kan ook op verschillende manieren
o Mechanisch
§ Dit gebeurt meestal door ultrasonicatie
§ Hierbij worden ultrasone geluidsgolven doorheen het proefbuisjes gestuurd
waardoor het DNA breekt
§ DNA is een robuuste molecule
• Maar niet als je het in de lengte bekijkt
o Dan is het redelijk fragiel
o Zo als een haar
• In de breedte is het wel heel moeilijk om te breken
§ Nadeel van deze methode
• Het DNA breekt op een willekeurige plaats
o Je kan zelf niet beslissen/controleren waar het breekt
o Hierdoor heb je willekeurige uiteinden wat ligatie moeilijk kan
maken
§ Voordeel van deze methode
• De fragmenten die je krijgt zijn wel ongeveer van gelijke lengte
ð Deze methode wordt niet gebruikt wanneer men DNA wil kloneren maar wel voor genoom
sequencing
oEnzymatisch
§ Voordeel
• Je kan wel controleren waar er geknipt wordt
• Hierdoor heb je sequentiespecifieke uiteinden
o Waardoor ligatie makkelijker kan gebeuren
§ Nadeel
• De fragmentlengte is sterk verschillend
ð Voor DNA klonatie is dit iets wat wel regelmatig gebruikt wordt
Enzymatische methode uitgelegd
- Het knippen van de DNA moleculen zal gebeuren door endonucleasen
o Met name restrictie endonucleasen (RE)
§ Een groep van enzymes die bijna allemaal uit bacteriën – prokaryoten komen
• Eukaryoten hebben deze enzymes niet
• Voor bacteriën vormen deze een soort van immuniteit
§ Deze RE hebben een specifieke herkenningsplaats
• Binden op het DNA thv een specifiek motiefje
• Dit is vaak een palindroom sequentie
- Wat gaan ze doen
2
, o Ze maken fosfodiëster breuken in beide enkelstrengen
- Na het knippen heb je een
o Vrije 5’ fosfaat
o Vrije 3’ OH groep
o Zonder deze vrije groepen zou je geen ligatie kunnen doen, dus is vrij belangrijk
Palindromen
- Dit is zo een vaste herkenningsplaats voor een RE
- Je moet altijd 5’ 3’ kijken!
o Dus ook in de onderste streng!
- Er kan op 3 verschillende manieren worden geknipt
o Beide strengen worden geknipt tussen de G en A
§ Geknipt 1 base na het 5’ uiteinde
§ EcoRI
o Kan ook 1 base na het 3’ uiteinde
§ PST 1
o Er kan ook in het midden worden geknipt
§ Sma 1
ð Je krijgt hierbij dus ook 3 verschillende types uiteinden
è Bij EcoRI en PST 1 krijg je na het uiteinde enkelstrengige stukjes à deze noemen sticky
uiteinden
o Dit enkelstrengige stukje is complementair met het ander enkelstrengig stukje dus
je kan deze aan elkaar plakken
o Deze bij de EcoRi zijn 5’ overhangend
o Bij PST 1 is het 3’ overhangend
ð Je kan de sticky ends van EcoRi en PST 1 dus niet aan elkaar plakken
ð Je kan enkel 5’ overhangend – 5’ overhangend aan elkaar hangen en twee keer 3’ overhangen
è Bij Sma1 à blunt uiteinde
o Hierbij is er geen overhangend stukje
o Je kan deze ook niet zomaar terug aan elkaar plakken
RE: nomenclatuur
- De resitrictie endonucleasen zijn allemaal afkomstig vanuit bacteriën
- Hun naam zal dan ook afgeleid zijn van de bacteriespecies waaruit ze werden geïsoleerd
o Bv: EcoRI van Escherichia Coli
3
, RE: host restriction
- Functie
o Ze zijn enkel aanwezig in bacteriën en dienen als beschreming
o Ze zorgen voor een selectieve afbraak van vreemd DNA
- Er is natuurlijk een kans dat het motiefje van het vreemde DNA sterk lijkt op dat van het
eigen DNA
o Daarom zal het eigen DNA beschermd worden door specifieke methylatie thv de
RE herkenningsplaatsen
o Dit noemt men host restriction
o Deze methylering zal vnl op de adenines gebeuren
§ Dit is op een adenine dicht bij de knip plaats
§ Hierdoor zal er involdoende plaats zijn voor het restrictie enzyme
RE knipfrequentie
- Aantal herkenningsplaatsen
o 4, 6 of 8 bp
§ Wanneer je kleine fragementen wil dan
• Dan worden RE gebruikt met een motief van 4 nucleotiden
• Statisch gezien zal een groepje van 4 nucleotiden meer voorkomen in
het genoom dan in van 6 of 8
§ De meest gebruikte is echter deze van 6 bp
- Samenstelling herkenningsplaats
o Verhouding CG/GC
§ CG zal 1 keer op de 4 GC voorkomen
- Methylatiegraad en gevoeligheid
Scheiding van DNA-fragmenten: elektroforese
- Dit zorgt voor een scheiding op lengte
- 3 types
o Agarose elektroforese
§ Wordt het meeste gebruikt
§ Kan zorgen voor een scheiding van 50bp tot 40 000
§ Resolutie à 10bp
o Puled field gel elektroforese
§ Voor heel grote fragementen
§ Zorgt voor een scheiding van 5000bp tot 10Mbp
§ Resolutie à 5kbp
o Polyacrylamide elektroforese
§ Voor kleine fragmenten
§ Scheiding van 10bp tot 1000 bp
§ Resolutie à 1bp!
ð Deze hebben allemaal een bepaalde resolutie = scheidend vermogen
o Dit scheidend vermogen geeft weer op hoeveel bp je fragementen uit elkaar kan
halen
o Bv scheidend vermogen van 10 bp wil zeggen dat het een onderscheid kan maken
tussen een fragment met 80 en 90 bp maar niet tussen 80 en 83 bp
4
