Samenvatting Weefselleer
1: Histologische technieken
Cytologie/histologie: morfologische wetenschap. Normale microscopische structuur van
levende organismen.
Doel histologische technieken: weefsels en organen observeerbaar maken voor licht- of
elektronenmicroscoop.
Probleem: weinig contrast in biologisch materiaal en weinig licht doorlatend.
Methodes:
1. Fixatie
2. Inbedden
3. Snijden
4. Kleuren of contrasteren
+kleuren
1.1 Fixatie
Bewaren van weefsels met behoud van oorspronkelijke structuur = denatureren van eiwitten
(stilleggen van bacteriële en autolytische afbraakreacties) à anders zal het weefsel
afbreken. Permeabiliseren van celmembraan (membraan permeabel maken, verwijdert
membraanlipiden). Harder en poreuzer (meer doorlatend) maken v/h weefsel.
à Methodes:
- Chemische fixatie: immersie (indompelen) of perfusie (vochttoevoeging) van het
weefsel met fixatief (fixeermiddel, stabiliserende verbindingen).
Bv. ethanol, azijnzuur, glutaaraldehyde, osmiumtetroxide, formaldehyde.
- Koude fixatie: invriezen v/h weefsel.
1.2 Inbedden
Gefixeerde materiaal omwikkelen en doordrengen met inbedmiddel.
Inbedmiddel:
- Substantie die weefsel indringt.
- Substantie die hard wordt.
- Materiaal snijdbaar in dunne plakken.
Bv. paraffine, hars, plastics, …
- Hydrofoob à weefsel bevat veel water:
à Eerst weefsel dehydrateren/ontwateren:
Weefsel in stijgende reeks alcoholbaden brengen: 30°, 50°, 70°, 90°,
absolute ethanol.
à Dan “Clearing” (stof zorgt voor doorzichtigheid) in tolueen: mengbaar met
alcohol en het inbedmiddel.
à Wordt geplaatst in paraffine en op 52°C-60°C verwarmt.
,1.3 Snijden
Het weefsel + inbedmateriaal kan worden gesneden in dunne plakken door de hardheid
ervan.
Paraffine: 5 µm (1-20 µm), doorlaatbaar voor licht (LM).
à Microtoom met en stalen mes.
Hars, plastics:
- 50 nm – 2 µm: half dunne coupes (LM).
à Microtoom met glazen mes.
- 70 nm (60-100 nm): doorlaatbaar voor elektronen (EM).
à Microtoom met glas- of diamantmes.
Microtoom:
Toestel om zeer dunne plakjes van iets te maken (hier ingebed weefsel).
1.4 Kleuren – Lichtmicroscopie
1.4.1 Helderveld – LM = bright field LM
Wit licht: spectrum van golflengtes (380-720 nm)(kleur).
Contrast in coupes laag à visualisatie van celbestanden en extracellulair materiaal in het
weefsel door te kleuren.
Kleurstoffen: vaak waterige oplossingen.
à zure, basische en indifferente kleurstoffen.
Coupes worden eerst gedeparaffineerd (tolueen).
1.4.2 Zure basische kleurstoffen
Gebaseerd op differentiële aanwezigheid van zure (-) en basische (+) weefselbestanden (na
denaturatie).
Bv. : Kern à veel zure groepen.
Cytoplasma à veel basische groepen.
à Zure groep kan H+ ionen afgeven.
Bv. -COOH Û -COO- + H+
à Basische groep kan H+ opnemen.
Bv. -NH2 + H+ Û -NH3+
Richting van evenwichtsreacties wordt bepaald door de pH v/h kleurmileu. (isoelectrisch
punt, IEP)
Weefsels bevatten meestal amfolieten (zowel zure als basische groepen).
,Routine histologische kleuring: Haematoxyline (blauw) – Eosine (roze) (HE).
Bv. de kern zal door Haematoxyline blauw kleuren en het cytoplasma eerder roze à
duidelijk verschil.
Spierweefsel
Kleurstoffen:
- Kationische (+) (basische) kleurstoffen (bv. Haematoxyline) (KI+OH-) reageren met
zure weefselbestandddelen.
- Anionische (-) (zure) kleurstoffen (bv. Eosine) (H+KI-) reageren met basishce
weefselbestanddelen.
- Basofiel: weefselcomponent die reageert met + kleurstof (is dus eerder zuur).
- Eosinofiel: weefselcomponent dat reageert met – kleurstof (is dus eerder basisch).
Soort kleurstof:
- Chromofoor: eigenlijke kleurdrager.
- Auxochroom: hydrofiel; maakt kleurstof wateroplosbaar en bindt chromofoor aan
het te kleuren weefsel.
Koolhydraten/suikers:
- Polysachariden, enkelvoudig of samengesteld. Ringstructuren.
- Vaak gebonden met andere soorten moleculen à maken ze complex.
à Meestal slecht kleurbaar met HE.
à Indien voorzorgen bij fixeren: kleurbaar met kationische kleurstoffen.
à Metachromasie (weefsel krijgt een andere kleur dan het kleur v/d kleurstof).
Vetten/lipiden:
- Vetzuren CnH2n+1 COOH
Hydrofoob Hydrofiel
à Vetten lossen op in alcohol à weinig kleurbaar bij routine doorwerking à witte
“vlekken/ruimtes” in preparaat.
à Neutrale vetten: kleurbaar met vetoplosbare kleurstoffen.
Bv. Soudan black (vriescoupes = moeten ingevroren zijn).
à Voor EM: OsO4: affiniteit voor vetzuurketens à visualiseerbaar (membranen zijn
duidelijk zichtbaar).
Metachromasie
Talrijke basische kleurstoffen kleuren bepaalde weefselstructuren niet in dezelfde kleur als
in de waterige oplossing (blauw), maar geven een rode of paarse kleur aan het weefsel.
à ontstaat door vorming van dimeren tussen kleurstoffen.
Bv. Zure glycosaminoglycanen (GAGs) in kraakbeen.
Sterk basofiele granules (met o.a. zure GAGs) in mastcellen.
,1.4.3 Andere kleurtechnieken
Enzymhistochemie
Activiteit van enzymen wordt aangetoond door et gebruik v/e voor een enzym specifiek
substraat. De reactie resulteert in de vorming v/e waarneembare neerslag.
Bv. dehydrogeneasen, fosfatasen, peroxidasen.
Autoradiografie
Histologische techniek om metabolische activiteit te visualiseren. Radioactief gemerkte
precursoren (is een stof die in een reactie in een andere stof wordt omgezet, bv. 3H-thymine)
worden ingebouwd, coupes maken en in contact brengen met fotografische emulsie (2 niet
in elkaar oplosbare vloeistoffen).
Histochemische kleurtechnieken
Indentificatie en lokalisatie van specifieke chemische groepen in cellen en weefsels.
- Periodic acid-Schiff (PAS) reactie: vrije polysachariden (bv. glycogeen) of gebonden
aan eiwitten (glycoproteïnen). Ook lipiden, mucines.
à gebaseerd op de oxidatieve werking van perjoodzuur waarbij glycolgroepen à
aldehydegroepen (O=C-H) die met Schiffreagens reageren à paarsrode kleur.
- Feulgen kleuring (Schiff-reagens): DNA.
Immunohistochemische (IH) kleuring
Aantonen van specifieke moleculen via antigen/antilichaambinding. Het antilichaam wordt
voorzien van een merker. (LM, FM, EM)
Betere kleuring
In Situ Hybridisatie (ISH)
Lokaliseren van specifieke nucleotidenvolgorden in DNA/RNA d.m.v. gemerkte DNA/RNA
probes (klein stukje enkelstrengig DNA/RNA).
à Bij IH en IST kleuringen maakt men vaak gebruik van fluorescentie-lichtmicroscopie
waarbij els kleurstof fluorescerende stoffen (fluorochromen) worden gebruikt.
- Door gebruik te maken van filters (excitatie-/sperfilter) zetten fluorochromen
excitatielicht v/e langere golflengte (bv. groen of rood).
- Fluorescerende delen v/h preparaat lichten hierdoor op tegen een donkere
achtergrond.
,1.5 Contrasteren – Elektronenmicroscopie
1.5.1 Transmissie EM (TEM) en scanning EM (SEM)
Elektronen worden versneld (1 golflengte) – geen kleur. Golflengte is buiten bereik v/d
gevoeligheid v/h menselijk oog (veel korter dan zichtbaar licht).
à Fotografische plaat (negatief) – fluorescenttiescherm – digitale camera.
- Beeldvorming:
Ontstaat door verschillen in electronenstrooiing op de atomen v/h doorstraalde
weefsel. Deze elektronen strooiing (afh. v/h atoomnummer) kan men doen
toenemen door toevoegen van zware metalen aan het weefsel.
Structuren waar de zware metalen op vastzitten laten geen elektronen door,
structuren zonder zware metalen laten wel elektronen door.
Deze laatste structuren zorgen voor ‘belichting’ v/h negatief (= zwart).
Op het positief krijgen we een omgekeerd beeld.
Elektronendense structuren zijn donker op EM foto’s. Zones die de elektronen
doorlaten (niet-elektronendens) zijn bleek.
- Vergelijkbaar LM: bbiologisch materiaal vertoont weinig densiteitverschillen.
- Verhogen van densiteit verschillen = contrasteren.
à zware metalen (toename van elektronenstrooiing à toename contrast).
- OsO4 (reeds bij fixatief)(vetten, affiniteit voor membranen).
- Uranylacetaat (reageert met fosfaat en aminogroepen: NZ en eiwitten)
- Loodcitraat (reageert met – groepen: NZ)
o Uranylacetaat + loodcitraat = contrasteringsvloeistof.
1.6 Observatiemethoden
1.6.1 Lichtmicroscopie (LM)
Beeldvorming: glazen lenzen.
Vergroting: product van oculair (10x) en objectieflens (4, 10,
40, 100x): max 1000x.
Scheidend (resolutie)vermogen = de capaciteit v/h
instrument om twee dicht naast elkaar gelegen punten te
ondescheiden (kwaliteit lenzen).
Resolutievermogen (RV) = 0.61 l/NA
l golflengte wit licht: 550 nm
NA (numerieke apertuur): n x sina
n: brekingsindex medium
à nlucht = 1; nimmersieolie = 1,5
a: helft tophoek lichtkegel
sin a: max. 1 (sin 90°)
max. scheidend vermogen: 250 nm
Contrast: kleurstoffen.
Beeld: rechtstreeks op het oog.
,Fluorescentiemicroscopie
Lichtbundel wordt gefilterd (excitatielicht/emissielicht).
Kleurstoffen: fluorochromen.
1.6.2 Elektronenmicroscoop
Magneetspoelen.
Vergroting: tot > 100.000x
Scheidend vermogen:
RV = 0.61 l/NA
l = 1.22/Öhoogspanning (nm)
Hoogspanning: bv. 100kV
NA = 10-3
à scheidend vermogen: 2-3 nm
(nieuwere EM tot 0,1 nm)
Contrast: zware metalen.
Beeld: flurescerend scherm/fotografische plaat/digitale camera
1.6.3 Samenvattend beeld
1.6.4 Speciale observatiemethoden (voor visaluatie van niet gekleurde cellen)
LM: helderveld, fasecontrast, interferentiecontrast
Door het plaatsen v/e faseplaatje tussen de condensor en het preparaat kunnen kliene
brekingsverschillen in het preparaat zichtbaar gemaakt worden.
, Fluorescentiemicroscoop
Fluorochromen:
- FITC met emissie groen licht: IH actine filamenten.
- DAPI met emissie in het blauw: kernkleuring.
- Acridine orange bindt NZ en zrogt voor gele kleur van DNA en oranje kleur van RNA in
kern.
Confocale microscopie
Visualiseert fluorescente merkers op basis van ‘virtuele’ secties doorheen het materiaal.
Virtuele microscopie
à bv. OlyVIA
WEEFSELS
Weefsels:
Cellen die dezelfde functie hebben en die samenwerken om die functie uit te voeren.
Tussen de cellen: acellulair compartiment à extracellulaire matrix.
Types:
- Epitheel (terbegrensing van oppervlakten)
- Bind- en steunweefsel (bloed, kraakbeen, …)
- Spierweefsel (weinig extracellulaire matrix)
- Zenuwweefsel
à cellen differentiëren naar een bepaald weefsel
1: Histologische technieken
Cytologie/histologie: morfologische wetenschap. Normale microscopische structuur van
levende organismen.
Doel histologische technieken: weefsels en organen observeerbaar maken voor licht- of
elektronenmicroscoop.
Probleem: weinig contrast in biologisch materiaal en weinig licht doorlatend.
Methodes:
1. Fixatie
2. Inbedden
3. Snijden
4. Kleuren of contrasteren
+kleuren
1.1 Fixatie
Bewaren van weefsels met behoud van oorspronkelijke structuur = denatureren van eiwitten
(stilleggen van bacteriële en autolytische afbraakreacties) à anders zal het weefsel
afbreken. Permeabiliseren van celmembraan (membraan permeabel maken, verwijdert
membraanlipiden). Harder en poreuzer (meer doorlatend) maken v/h weefsel.
à Methodes:
- Chemische fixatie: immersie (indompelen) of perfusie (vochttoevoeging) van het
weefsel met fixatief (fixeermiddel, stabiliserende verbindingen).
Bv. ethanol, azijnzuur, glutaaraldehyde, osmiumtetroxide, formaldehyde.
- Koude fixatie: invriezen v/h weefsel.
1.2 Inbedden
Gefixeerde materiaal omwikkelen en doordrengen met inbedmiddel.
Inbedmiddel:
- Substantie die weefsel indringt.
- Substantie die hard wordt.
- Materiaal snijdbaar in dunne plakken.
Bv. paraffine, hars, plastics, …
- Hydrofoob à weefsel bevat veel water:
à Eerst weefsel dehydrateren/ontwateren:
Weefsel in stijgende reeks alcoholbaden brengen: 30°, 50°, 70°, 90°,
absolute ethanol.
à Dan “Clearing” (stof zorgt voor doorzichtigheid) in tolueen: mengbaar met
alcohol en het inbedmiddel.
à Wordt geplaatst in paraffine en op 52°C-60°C verwarmt.
,1.3 Snijden
Het weefsel + inbedmateriaal kan worden gesneden in dunne plakken door de hardheid
ervan.
Paraffine: 5 µm (1-20 µm), doorlaatbaar voor licht (LM).
à Microtoom met en stalen mes.
Hars, plastics:
- 50 nm – 2 µm: half dunne coupes (LM).
à Microtoom met glazen mes.
- 70 nm (60-100 nm): doorlaatbaar voor elektronen (EM).
à Microtoom met glas- of diamantmes.
Microtoom:
Toestel om zeer dunne plakjes van iets te maken (hier ingebed weefsel).
1.4 Kleuren – Lichtmicroscopie
1.4.1 Helderveld – LM = bright field LM
Wit licht: spectrum van golflengtes (380-720 nm)(kleur).
Contrast in coupes laag à visualisatie van celbestanden en extracellulair materiaal in het
weefsel door te kleuren.
Kleurstoffen: vaak waterige oplossingen.
à zure, basische en indifferente kleurstoffen.
Coupes worden eerst gedeparaffineerd (tolueen).
1.4.2 Zure basische kleurstoffen
Gebaseerd op differentiële aanwezigheid van zure (-) en basische (+) weefselbestanden (na
denaturatie).
Bv. : Kern à veel zure groepen.
Cytoplasma à veel basische groepen.
à Zure groep kan H+ ionen afgeven.
Bv. -COOH Û -COO- + H+
à Basische groep kan H+ opnemen.
Bv. -NH2 + H+ Û -NH3+
Richting van evenwichtsreacties wordt bepaald door de pH v/h kleurmileu. (isoelectrisch
punt, IEP)
Weefsels bevatten meestal amfolieten (zowel zure als basische groepen).
,Routine histologische kleuring: Haematoxyline (blauw) – Eosine (roze) (HE).
Bv. de kern zal door Haematoxyline blauw kleuren en het cytoplasma eerder roze à
duidelijk verschil.
Spierweefsel
Kleurstoffen:
- Kationische (+) (basische) kleurstoffen (bv. Haematoxyline) (KI+OH-) reageren met
zure weefselbestandddelen.
- Anionische (-) (zure) kleurstoffen (bv. Eosine) (H+KI-) reageren met basishce
weefselbestanddelen.
- Basofiel: weefselcomponent die reageert met + kleurstof (is dus eerder zuur).
- Eosinofiel: weefselcomponent dat reageert met – kleurstof (is dus eerder basisch).
Soort kleurstof:
- Chromofoor: eigenlijke kleurdrager.
- Auxochroom: hydrofiel; maakt kleurstof wateroplosbaar en bindt chromofoor aan
het te kleuren weefsel.
Koolhydraten/suikers:
- Polysachariden, enkelvoudig of samengesteld. Ringstructuren.
- Vaak gebonden met andere soorten moleculen à maken ze complex.
à Meestal slecht kleurbaar met HE.
à Indien voorzorgen bij fixeren: kleurbaar met kationische kleurstoffen.
à Metachromasie (weefsel krijgt een andere kleur dan het kleur v/d kleurstof).
Vetten/lipiden:
- Vetzuren CnH2n+1 COOH
Hydrofoob Hydrofiel
à Vetten lossen op in alcohol à weinig kleurbaar bij routine doorwerking à witte
“vlekken/ruimtes” in preparaat.
à Neutrale vetten: kleurbaar met vetoplosbare kleurstoffen.
Bv. Soudan black (vriescoupes = moeten ingevroren zijn).
à Voor EM: OsO4: affiniteit voor vetzuurketens à visualiseerbaar (membranen zijn
duidelijk zichtbaar).
Metachromasie
Talrijke basische kleurstoffen kleuren bepaalde weefselstructuren niet in dezelfde kleur als
in de waterige oplossing (blauw), maar geven een rode of paarse kleur aan het weefsel.
à ontstaat door vorming van dimeren tussen kleurstoffen.
Bv. Zure glycosaminoglycanen (GAGs) in kraakbeen.
Sterk basofiele granules (met o.a. zure GAGs) in mastcellen.
,1.4.3 Andere kleurtechnieken
Enzymhistochemie
Activiteit van enzymen wordt aangetoond door et gebruik v/e voor een enzym specifiek
substraat. De reactie resulteert in de vorming v/e waarneembare neerslag.
Bv. dehydrogeneasen, fosfatasen, peroxidasen.
Autoradiografie
Histologische techniek om metabolische activiteit te visualiseren. Radioactief gemerkte
precursoren (is een stof die in een reactie in een andere stof wordt omgezet, bv. 3H-thymine)
worden ingebouwd, coupes maken en in contact brengen met fotografische emulsie (2 niet
in elkaar oplosbare vloeistoffen).
Histochemische kleurtechnieken
Indentificatie en lokalisatie van specifieke chemische groepen in cellen en weefsels.
- Periodic acid-Schiff (PAS) reactie: vrije polysachariden (bv. glycogeen) of gebonden
aan eiwitten (glycoproteïnen). Ook lipiden, mucines.
à gebaseerd op de oxidatieve werking van perjoodzuur waarbij glycolgroepen à
aldehydegroepen (O=C-H) die met Schiffreagens reageren à paarsrode kleur.
- Feulgen kleuring (Schiff-reagens): DNA.
Immunohistochemische (IH) kleuring
Aantonen van specifieke moleculen via antigen/antilichaambinding. Het antilichaam wordt
voorzien van een merker. (LM, FM, EM)
Betere kleuring
In Situ Hybridisatie (ISH)
Lokaliseren van specifieke nucleotidenvolgorden in DNA/RNA d.m.v. gemerkte DNA/RNA
probes (klein stukje enkelstrengig DNA/RNA).
à Bij IH en IST kleuringen maakt men vaak gebruik van fluorescentie-lichtmicroscopie
waarbij els kleurstof fluorescerende stoffen (fluorochromen) worden gebruikt.
- Door gebruik te maken van filters (excitatie-/sperfilter) zetten fluorochromen
excitatielicht v/e langere golflengte (bv. groen of rood).
- Fluorescerende delen v/h preparaat lichten hierdoor op tegen een donkere
achtergrond.
,1.5 Contrasteren – Elektronenmicroscopie
1.5.1 Transmissie EM (TEM) en scanning EM (SEM)
Elektronen worden versneld (1 golflengte) – geen kleur. Golflengte is buiten bereik v/d
gevoeligheid v/h menselijk oog (veel korter dan zichtbaar licht).
à Fotografische plaat (negatief) – fluorescenttiescherm – digitale camera.
- Beeldvorming:
Ontstaat door verschillen in electronenstrooiing op de atomen v/h doorstraalde
weefsel. Deze elektronen strooiing (afh. v/h atoomnummer) kan men doen
toenemen door toevoegen van zware metalen aan het weefsel.
Structuren waar de zware metalen op vastzitten laten geen elektronen door,
structuren zonder zware metalen laten wel elektronen door.
Deze laatste structuren zorgen voor ‘belichting’ v/h negatief (= zwart).
Op het positief krijgen we een omgekeerd beeld.
Elektronendense structuren zijn donker op EM foto’s. Zones die de elektronen
doorlaten (niet-elektronendens) zijn bleek.
- Vergelijkbaar LM: bbiologisch materiaal vertoont weinig densiteitverschillen.
- Verhogen van densiteit verschillen = contrasteren.
à zware metalen (toename van elektronenstrooiing à toename contrast).
- OsO4 (reeds bij fixatief)(vetten, affiniteit voor membranen).
- Uranylacetaat (reageert met fosfaat en aminogroepen: NZ en eiwitten)
- Loodcitraat (reageert met – groepen: NZ)
o Uranylacetaat + loodcitraat = contrasteringsvloeistof.
1.6 Observatiemethoden
1.6.1 Lichtmicroscopie (LM)
Beeldvorming: glazen lenzen.
Vergroting: product van oculair (10x) en objectieflens (4, 10,
40, 100x): max 1000x.
Scheidend (resolutie)vermogen = de capaciteit v/h
instrument om twee dicht naast elkaar gelegen punten te
ondescheiden (kwaliteit lenzen).
Resolutievermogen (RV) = 0.61 l/NA
l golflengte wit licht: 550 nm
NA (numerieke apertuur): n x sina
n: brekingsindex medium
à nlucht = 1; nimmersieolie = 1,5
a: helft tophoek lichtkegel
sin a: max. 1 (sin 90°)
max. scheidend vermogen: 250 nm
Contrast: kleurstoffen.
Beeld: rechtstreeks op het oog.
,Fluorescentiemicroscopie
Lichtbundel wordt gefilterd (excitatielicht/emissielicht).
Kleurstoffen: fluorochromen.
1.6.2 Elektronenmicroscoop
Magneetspoelen.
Vergroting: tot > 100.000x
Scheidend vermogen:
RV = 0.61 l/NA
l = 1.22/Öhoogspanning (nm)
Hoogspanning: bv. 100kV
NA = 10-3
à scheidend vermogen: 2-3 nm
(nieuwere EM tot 0,1 nm)
Contrast: zware metalen.
Beeld: flurescerend scherm/fotografische plaat/digitale camera
1.6.3 Samenvattend beeld
1.6.4 Speciale observatiemethoden (voor visaluatie van niet gekleurde cellen)
LM: helderveld, fasecontrast, interferentiecontrast
Door het plaatsen v/e faseplaatje tussen de condensor en het preparaat kunnen kliene
brekingsverschillen in het preparaat zichtbaar gemaakt worden.
, Fluorescentiemicroscoop
Fluorochromen:
- FITC met emissie groen licht: IH actine filamenten.
- DAPI met emissie in het blauw: kernkleuring.
- Acridine orange bindt NZ en zrogt voor gele kleur van DNA en oranje kleur van RNA in
kern.
Confocale microscopie
Visualiseert fluorescente merkers op basis van ‘virtuele’ secties doorheen het materiaal.
Virtuele microscopie
à bv. OlyVIA
WEEFSELS
Weefsels:
Cellen die dezelfde functie hebben en die samenwerken om die functie uit te voeren.
Tussen de cellen: acellulair compartiment à extracellulaire matrix.
Types:
- Epitheel (terbegrensing van oppervlakten)
- Bind- en steunweefsel (bloed, kraakbeen, …)
- Spierweefsel (weinig extracellulaire matrix)
- Zenuwweefsel
à cellen differentiëren naar een bepaald weefsel
