Samenvatting Moleculaire genetica en epigenetica

Moleculaire genetica en
epigenetica
ZSO 2: Bibliotheken (genomische,
chromosomaal, cDNA)
Achtergrond
Nucleotide sequentie van een genoom is gekend  individueel gen kan makkelijk
geïsoleerd worden en in grote aantallen geproduceerd worden
Recombinant DNA technologie: de mogelijkheid om DNA te manipuleren met
precisie in een testbuisje of een organisme
- Splitsen van DNA op specifieke plaatsen door restrictie nuclease
- DNA ligatie: mogelijk om 2 stukken DNA samen te voegen
- DNA kloning: het maken van identieke kopieën van een DNA fragment of
het isoleren van een DNA fragment door vele kopieën van enkel dat
fragment te maken
- Hybridisatie van nucleïnezuur: specifieke sequenties van DNA of RNA
identificeren
- DNA synthese: chemisch synthetiseren van DNA met eender welke
sequentie
- Snelle bepaling van een sequentie van nucleotiden van DNA of RNA

Genetische ziektes
1 genmutatie kan effect hebben op de functie van een enzym  soms grote




gevolgen

Phenylketonuria
= een recessieve mutatie van het gen voor phenylalanine hydroxylase op de
lange arm van chromosoom 12

1

,  Phenylalamine kan niet omgezet worden in tyrosine
Phenylalamine = een essentiëel aminozuur, moet gehaald worden uit de voeding
- Te veel aan phenylalamine wordt omgezet naar phenylpyruvic zuur
- Schadelijk voor de cellen van het centraal zenuwstelsel  ernstige
mentale aftakeling, trage groei, vroege dood
Tyrosine wordt niet aangemaakt, nodig voor proteïne synthese, productie van
thyroxine, adrenaline en melanine
- Patiënten hebben een lichte huid en blauwe ogen
Behandeling: opletten op de voeding zodat er niet te veel en te weinig
phenylalamine wordt opgenomen
- Genoeg voor de normale ontwikkeling van het zenuwstelsel
- Niet te veel voor de mentale aftakeling
- Moet beginnen 1 à 2 maanden na de geboorte
- Voor zwangere vrouwen ook voor en tijdens de zwangerschap dit dieet
aanhouden

Albinisme
= een autosomaal recessieve mutatie
- In het gen dat tyrosinase maakt (zet tyrosine om in DOPA  bruine
pigment hiervan afkomstig)
- Ook andere mutaties mogelijk
 Ouders die beide albinisme hebben maar mutaties hebben op andere
genen kunnen wel normale kinderen krijgen
Melanine absorbeert ultraviolet licht + beschermt de huid tegen schadelijke UV
straling
Symptomen: witte huid, wit haar en rode ogen + gevoelig voor het licht

Sickelcel anemie
= een autosomale mutatie
- In het gen dat hemoglobine maakt  homozygoot voor de mutatie =
sickelcel anemie ; heterozygoot voor de mutatie = sickelcel trait
- De vorm van rode bloedcellen verandert waardoor ze fragieler worden en
minder soepel
o Leidt tot anemie
- Hebben vele gezondheidsproblemen

Mucovisidose
= autosomaal recessieve ziekte
- Deletie in het gen dat een Cl- kanaal maakt
- Taai slijm gemaakt (problemen pancreas, luchtwegsysteem en
spijsverteringssysteem)
- Behandeling: kloppen op de borst en rug + antibiotica voor infecties

DNA bibliotheken
Def. een verzameling van DNA-fragmenten die in vectoren zijn gekloneerd, zodat
onderzoekers die DNA-fragmenten die hen interesseren kunnen identificeren,
isoleren en verder analyseren
Waarom?
 Een genoom is veel te groot om te sequencen

2

,  1 chromosoom heeft meer dan 250 miljoen basenparen
DNA labelen: DNA polymerasen met nucleotiden die de modificatie hebben

Aanmaak van bibliotheken
1) Extractie van het DNA
2) DNA in stukjes knippen met behulp van:
o Restrictie endonuclease: knippen het DNA op specifieke plaatsen
onder de juiste omstandigheden  niet volledige vertering van het
DNA
 Kan direct gebruikt worden in een cloning vector
o Mechanische stuk maken: geluidsgolven, naald, …
 Moet eerst nog sticky ends krijgen voor het in een vector kan
! overlappende stukjes van geschikte grote vormen anders:
- Een specifieke regio dat bestudeert moet worden kan 1 of meer
plaatsen voor het restrictie-enzym bevatten  in stukken en niet
meer bruikbaar
- Grote van de fragmenten is meestal klein  vele genen zijn
groter + heel veel recombinant DNA
- Aantal base tussen de restrictieplaatsen is variabel  sommige
stukken te groot en niet kloonbaar
- Geen idee hoe de stukken achter elkaar passen  veel
informatie verloren
3) Van elk DNA fragment vele kopieën maken
o DNA fragment in een plasmide vector (met ligase samengevoegd)
o Transformatie = plasmide in een bacterie brengen
o Als bacterie vermenigvuldigt, vermenigvuldigt het DNA fragment
mee
 Heel snel vele kopieën maken van een stukje DNA
4) De DNA fragmenten gesorteerd op basis van grote met behulp van
gelelektroforese
Een kloningsvector of plasmide:
- Cirkelvormig, dubbelstrengig DNA molecule
- Kan opgenomen worden in een gastheer
- Kan je DNA-fragment plakken (dichtplakken met ligase)
- Kan mee vermenigvuldigd worden
- Vaak E. Coli gebruikt  met slechts 1 à 2 bacteriële artificiële
chromosomen
o Stabiel, kan grote stukken DNA bevatten, makkelijk te gebruiken
Controle of het gen is opgenomen
 lacZ gen op de plaats waar het DNA wordt ingebracht
o gen intact, geen DNA ingebracht, lacZ geproduceert, kolonie is
blauw
o gen niet intact, DNA ingebracht, geen lacZ geproduceert, kolonie is
wit
 Antibiotica resistent gen aanwezig
o Plasmide ingebracht in de gastheer, gastheer kan overleven in een
milieu met antibiotica
1 kolonie bevat vele kopieën van 1 specifiek stukje DNA
Genomische bibliotheek: stelt het volledig genomisch DNA van een organisme
voor

3