Inhoud
Inleiding ................................................................................................................................................... 2
Belangrijke eigenschappen van nanobodies ........................................................................................... 4
Proces ...................................................................................................................................................... 6
Toepassingen nanobodies ....................................................................................................................... 8
Meer gerichte afgifte van medicijnen, vaccins,… via nanobody ‘corona’ lipide nanopartikels –
introductie derivatisatie van proteïnen ................................................................................................ 20
Voorkomen van scFv (dimeer) CAR-T problemen door gebruik van nanobodies (monomeer)............ 24
Gemak van nanobody concatenering.................................................................................................... 25
1
,Topic 2: Enkel keten antilichamen, VHHs
of ‘nanobodies’: principes & toepassingen
Inleiding
• Antilichamen kunnen opgewekt worden in konijnen, rat, muis, geiten
(recent wordt geleidelijk ook meer gebruik gemaakt van naieve antilichaam libraries of zelf
van synthetische antilichaam libraries)
• Antigeen?
o synthetische peptiden, eiwit(fragmenten), eiwitten, kleine moleculen, cellen,
bacteriën, virussen,...
• Indien geen antilichaam voorhanden is kan het antigeen toch onderzocht worden door een
korte ‘tag’ sequentie eraan te koppelen op cDNA niveau
o Liefst zo kort mogelijk
o Nadeel: tag kan biologische functie van eiwit beïnvloeden
▪ Tubuline bv. is gevoelig aan tags → 3 aa tag verandert functie !
o Vb. van tags: Myc, HA, His6, V5, …….., GST, MBP, GFP
▪ GST (gluthathion S transferase), MBP (maltose binding protein) , GFP (green
fluorescent protein) zijn niet bepaald klein! → 200-250aa
-> dit wordt gekloneerd plasmide
-> vervolgens wordt dit plasmide getransfecteerd in cellen
-> cDNA/eiwit wordt tot overexpressie gebracht
-> lokalisatie eiwit via immunocytochemie bestuderen
• Antilichamen in het algemeen worden gebruikt als onderzoeksinstrument in labo
(immunocytochemie, Western blot,…
Maar ook als diagnosticum (lateral flow assay, Covid-19 test, pregnancy test, biosensors,…)
En natuurlijk als therapeutish agens (zie verder)
2
, • Maar: antistoffen hebben ook nadelen
o Reproduceerbaarheid
• Recombinante antilichamen
o Minder issues rond reproduceerbaarheid omdat DNA en eiwitsequentie beschikbaar
zijn Dus iedere gebruiker kan weten welk antilichaam werd gebruikt in een bepaalde
studie en zijn resultaten vergelijken met andere studies – zelfde antilichaam werd
gebruikt
o Hoewel antibody libraries worden gemaakt de laatste jaren hebben ze nog niet
zoveel gebruikers. Dat komt deels omdat die een mentaliteitswijziging vraagt bij
onderzoekers en zoiets kan decennia duren
o Men vertrouwt nog steeds op de monoclonale die al vele jaren worden gebruikt.
o We gaan hier verder in op een subklasse van monoclonale antilichamen omdat ze
speciale eigenschappen en toepassingen hebben.
Hun DNA/eiwit sequentie is steeds beschikbaar.
o Ze heten ‘Nanobodies’ en werden in België ontdekt. Vandaag worden ze wereldwijd
gebruikt en toegepast in uiteenlopende domeinen om verschillende ziekten te
behandelen
• IgG, scFv, VHH
o Human IgG immunoglobulin
▪ = conventioneel antilichaam
▪ Fab
➢ = fragment antigen binding
➢ Elk blokje ~ 15 kD → 4x15 = 60 kD
▪ scFv
➢ = single chain Fv fragment
➢ Minimal stukje nodig om te binden met antigen
➢ Als je ze uit elkaar haalt ga je hydrofobe interface blootstellen aan
hydrofiele omgeving waardoor hele zaak zal precipiteren
o Lama immunoglobulin
▪ = zware keten antilichaam
▪ Zonder lichte ketens
▪ CH1 is normaal onderdeel van zware keten maar ontbreekt omdat het
normaal fungeert als aanhechtingspunt voor lichte ketens
▪ Hydrofobe aminozuren bij VH, VL zijn gemuteerd naar hydrofiele aminozuren
bij VHH
o VHH single domain antibody
▪ = nanobody
▪ = antigen binding fragment
▪ 15 kDa
▪ Enkelvoudige keten van aminozuren (ca 120 aa)
3
Inleiding ................................................................................................................................................... 2
Belangrijke eigenschappen van nanobodies ........................................................................................... 4
Proces ...................................................................................................................................................... 6
Toepassingen nanobodies ....................................................................................................................... 8
Meer gerichte afgifte van medicijnen, vaccins,… via nanobody ‘corona’ lipide nanopartikels –
introductie derivatisatie van proteïnen ................................................................................................ 20
Voorkomen van scFv (dimeer) CAR-T problemen door gebruik van nanobodies (monomeer)............ 24
Gemak van nanobody concatenering.................................................................................................... 25
1
,Topic 2: Enkel keten antilichamen, VHHs
of ‘nanobodies’: principes & toepassingen
Inleiding
• Antilichamen kunnen opgewekt worden in konijnen, rat, muis, geiten
(recent wordt geleidelijk ook meer gebruik gemaakt van naieve antilichaam libraries of zelf
van synthetische antilichaam libraries)
• Antigeen?
o synthetische peptiden, eiwit(fragmenten), eiwitten, kleine moleculen, cellen,
bacteriën, virussen,...
• Indien geen antilichaam voorhanden is kan het antigeen toch onderzocht worden door een
korte ‘tag’ sequentie eraan te koppelen op cDNA niveau
o Liefst zo kort mogelijk
o Nadeel: tag kan biologische functie van eiwit beïnvloeden
▪ Tubuline bv. is gevoelig aan tags → 3 aa tag verandert functie !
o Vb. van tags: Myc, HA, His6, V5, …….., GST, MBP, GFP
▪ GST (gluthathion S transferase), MBP (maltose binding protein) , GFP (green
fluorescent protein) zijn niet bepaald klein! → 200-250aa
-> dit wordt gekloneerd plasmide
-> vervolgens wordt dit plasmide getransfecteerd in cellen
-> cDNA/eiwit wordt tot overexpressie gebracht
-> lokalisatie eiwit via immunocytochemie bestuderen
• Antilichamen in het algemeen worden gebruikt als onderzoeksinstrument in labo
(immunocytochemie, Western blot,…
Maar ook als diagnosticum (lateral flow assay, Covid-19 test, pregnancy test, biosensors,…)
En natuurlijk als therapeutish agens (zie verder)
2
, • Maar: antistoffen hebben ook nadelen
o Reproduceerbaarheid
• Recombinante antilichamen
o Minder issues rond reproduceerbaarheid omdat DNA en eiwitsequentie beschikbaar
zijn Dus iedere gebruiker kan weten welk antilichaam werd gebruikt in een bepaalde
studie en zijn resultaten vergelijken met andere studies – zelfde antilichaam werd
gebruikt
o Hoewel antibody libraries worden gemaakt de laatste jaren hebben ze nog niet
zoveel gebruikers. Dat komt deels omdat die een mentaliteitswijziging vraagt bij
onderzoekers en zoiets kan decennia duren
o Men vertrouwt nog steeds op de monoclonale die al vele jaren worden gebruikt.
o We gaan hier verder in op een subklasse van monoclonale antilichamen omdat ze
speciale eigenschappen en toepassingen hebben.
Hun DNA/eiwit sequentie is steeds beschikbaar.
o Ze heten ‘Nanobodies’ en werden in België ontdekt. Vandaag worden ze wereldwijd
gebruikt en toegepast in uiteenlopende domeinen om verschillende ziekten te
behandelen
• IgG, scFv, VHH
o Human IgG immunoglobulin
▪ = conventioneel antilichaam
▪ Fab
➢ = fragment antigen binding
➢ Elk blokje ~ 15 kD → 4x15 = 60 kD
▪ scFv
➢ = single chain Fv fragment
➢ Minimal stukje nodig om te binden met antigen
➢ Als je ze uit elkaar haalt ga je hydrofobe interface blootstellen aan
hydrofiele omgeving waardoor hele zaak zal precipiteren
o Lama immunoglobulin
▪ = zware keten antilichaam
▪ Zonder lichte ketens
▪ CH1 is normaal onderdeel van zware keten maar ontbreekt omdat het
normaal fungeert als aanhechtingspunt voor lichte ketens
▪ Hydrofobe aminozuren bij VH, VL zijn gemuteerd naar hydrofiele aminozuren
bij VHH
o VHH single domain antibody
▪ = nanobody
▪ = antigen binding fragment
▪ 15 kDa
▪ Enkelvoudige keten van aminozuren (ca 120 aa)
3
