Inhoud
Wat is gen/genoom editing? ................................................................................................................... 3
Basis principe van genoom editing door endonucleases ........................................................................ 3
Twee belangrijke repair pathways van DSBs ........................................................................................... 3
Drie veelgebruikte systemen voor gerichte genoom editing .................................................................. 4
Overzicht van belangrijke ontdekkingen in CRISPR/Cas-onderzoek ....................................................... 4
Waarom is er een 'CRISPR-rage'? ............................................................................................................ 4
Wat is CRISPR (CRISPR-Cas; CRISPR-Cas9)? ............................................................................................. 5
Hoe werkt CRISPR/Cas9 in bacteriën?..................................................................................................... 6
Hoe werd CRISPR/Cas9 aangepast voor genoom editing in het lab?...................................................... 6
CRISPR/Cas9 in de praktijk ...................................................................................................................... 7
1. Een gen knock-out met CRISPR/Cas9 via NHEJ ............................................................................... 7
Huidige CRISPR-workflow ................................................................................................................ 8
2. Een gen knock-out met CRISPR/Cas9 via HDR............................................................................... 13
Huidige CRISPR-workflow .............................................................................................................. 14
3. Een gen/DNA fragment/SNP (single nucleotide polymorfism) mutatie… knock-in met
CRISPR/Cas9 via HDR ......................................................................................................................... 15
Voorbeeld: knock-in van een epitoop tag gen (bv. HA) in het cellulaire genoom (HSP60) met
CRISPR/Cas9 .................................................................................................................................. 15
Toepassingen CRISPR/Cas9-systeem ..................................................................................................... 16
Mogelijke toepassingen CRISPR/Cas9-systeem..................................................................................... 20
Publicaties met gebruik van CRISPR/Cas9-systeem .............................................................................. 20
In vivo CRISPR/Cas9 ............................................................................................................................... 21
Twee types van genetisch onderzoek in muizen............................................................................... 21
De pre-CRISPR methode uitgaande van ES cellen ............................................................................. 21
Homologe recombinatie (HR) zonder nuclease ............................................................................ 23
Types van in vivo genetische modificaties .................................................................................... 23
Het Cre recombinase-LoxP systeem .............................................................................................. 23
Het kleine broertje van Cre-LoxP: het FLP-FRT systeem ............................................................... 24
Combinatie van Cre-LoxP met FLP-FRT systeem ........................................................................... 24
The European Conditional Mouse Mutagenesis (EUCOMM) program ......................................... 25
Conditioneel transgen op basis van CreLoxP in het locus ROSA26 ............................................... 25
Cre-LoxP-gebaseerd knock-in allel in de endogene locus ............................................................. 26
CRISPR/Cas9 gaat in zygoten en omzeilt zo ES-cellen en chimera's! ................................................ 26
In vivo CRISPR/Cas9 in de praktijk ......................................................................................................... 27
Easi-CRISPR maakt grote genomische vervangingen mogelijk.............................................................. 27
Easi-CRISPR heeft slechts zeer korte homologie-armen nodig ......................................................... 28
Easi-CRISPR werkt ook met één knip................................................................................................. 28
1
, Easi-CRISPR is erg efficiënt ................................................................................................................ 28
Easi-CRISPR is super snel ................................................................................................................... 29
CRISPR/Cas9 in mensen ? ...................................................................................................................... 29
De allereerste genetisch gemodificeerde baby’s !? .......................................................................... 29
CRISPR/Cas9 op weg naar de kliniek... .............................................................................................. 29
Het eerste gepubliceerde rapport over het gebruik van CRISPR/Cas9 om een erfelijke ziekte te
behandelen! ...................................................................................................................................... 30
2
, Les 2: in vitro en in vivo genoom editing
door CRISPR/Cas9 technologie
Wat is gen/genoom editing?
• Een proces waarbij onderzoekers een modificatie in een endogeen gen kunnen aanbrengen
(<-> les 1: exogeen DNA binnenbrengen in cel)
• Disruptie, insertie, vervanging op een locus in het genoom
o Genexpressie regelen
o SNP creëren
o Reporterfusies maken met behoud van endogene genregulatie
Basis principe van genoom editing door endonucleases
• Endonucleases creëren DSBs (double strand breaks) in het genoom
• Ze worden naar een specifieke plaats in het genoom geleid door een fusie met een DNA-
bindend eiwit of door een complementaire RNA molecule
(vroegere technieken: eiwit, bij CRISPR/Cas9: complementaire RNA molecule)
• DSBs worden dan gerepareerd door de endogene cellulaire DNA schade herstelmechanismen
• Non-Homologous End Joining (NHEJ) maakt fouten die leiden tot indels (= insertie/deletie)
• Wanneer een exogeen homoloog DNA template wordt geleverd, kan Homology Directed
Repair (HDR) het beschadigde DNA vervangen en zo elke gewenste specifieke mutatie
invoegen
Twee belangrijke repair pathways van DSBs
• NHEJ → Knock-outs creëren
o Meer foutgevoeliger (error prone)
o Creëert indels
o Gebruikt geen template
o Komt met hogere frequentie voor
• HDR → Knock-ins, fusies, etc creëren
o heeft een homoloog template
(donor) nodig
o inefficiënt, maar nauwkeuriger
3
Wat is gen/genoom editing? ................................................................................................................... 3
Basis principe van genoom editing door endonucleases ........................................................................ 3
Twee belangrijke repair pathways van DSBs ........................................................................................... 3
Drie veelgebruikte systemen voor gerichte genoom editing .................................................................. 4
Overzicht van belangrijke ontdekkingen in CRISPR/Cas-onderzoek ....................................................... 4
Waarom is er een 'CRISPR-rage'? ............................................................................................................ 4
Wat is CRISPR (CRISPR-Cas; CRISPR-Cas9)? ............................................................................................. 5
Hoe werkt CRISPR/Cas9 in bacteriën?..................................................................................................... 6
Hoe werd CRISPR/Cas9 aangepast voor genoom editing in het lab?...................................................... 6
CRISPR/Cas9 in de praktijk ...................................................................................................................... 7
1. Een gen knock-out met CRISPR/Cas9 via NHEJ ............................................................................... 7
Huidige CRISPR-workflow ................................................................................................................ 8
2. Een gen knock-out met CRISPR/Cas9 via HDR............................................................................... 13
Huidige CRISPR-workflow .............................................................................................................. 14
3. Een gen/DNA fragment/SNP (single nucleotide polymorfism) mutatie… knock-in met
CRISPR/Cas9 via HDR ......................................................................................................................... 15
Voorbeeld: knock-in van een epitoop tag gen (bv. HA) in het cellulaire genoom (HSP60) met
CRISPR/Cas9 .................................................................................................................................. 15
Toepassingen CRISPR/Cas9-systeem ..................................................................................................... 16
Mogelijke toepassingen CRISPR/Cas9-systeem..................................................................................... 20
Publicaties met gebruik van CRISPR/Cas9-systeem .............................................................................. 20
In vivo CRISPR/Cas9 ............................................................................................................................... 21
Twee types van genetisch onderzoek in muizen............................................................................... 21
De pre-CRISPR methode uitgaande van ES cellen ............................................................................. 21
Homologe recombinatie (HR) zonder nuclease ............................................................................ 23
Types van in vivo genetische modificaties .................................................................................... 23
Het Cre recombinase-LoxP systeem .............................................................................................. 23
Het kleine broertje van Cre-LoxP: het FLP-FRT systeem ............................................................... 24
Combinatie van Cre-LoxP met FLP-FRT systeem ........................................................................... 24
The European Conditional Mouse Mutagenesis (EUCOMM) program ......................................... 25
Conditioneel transgen op basis van CreLoxP in het locus ROSA26 ............................................... 25
Cre-LoxP-gebaseerd knock-in allel in de endogene locus ............................................................. 26
CRISPR/Cas9 gaat in zygoten en omzeilt zo ES-cellen en chimera's! ................................................ 26
In vivo CRISPR/Cas9 in de praktijk ......................................................................................................... 27
Easi-CRISPR maakt grote genomische vervangingen mogelijk.............................................................. 27
Easi-CRISPR heeft slechts zeer korte homologie-armen nodig ......................................................... 28
Easi-CRISPR werkt ook met één knip................................................................................................. 28
1
, Easi-CRISPR is erg efficiënt ................................................................................................................ 28
Easi-CRISPR is super snel ................................................................................................................... 29
CRISPR/Cas9 in mensen ? ...................................................................................................................... 29
De allereerste genetisch gemodificeerde baby’s !? .......................................................................... 29
CRISPR/Cas9 op weg naar de kliniek... .............................................................................................. 29
Het eerste gepubliceerde rapport over het gebruik van CRISPR/Cas9 om een erfelijke ziekte te
behandelen! ...................................................................................................................................... 30
2
, Les 2: in vitro en in vivo genoom editing
door CRISPR/Cas9 technologie
Wat is gen/genoom editing?
• Een proces waarbij onderzoekers een modificatie in een endogeen gen kunnen aanbrengen
(<-> les 1: exogeen DNA binnenbrengen in cel)
• Disruptie, insertie, vervanging op een locus in het genoom
o Genexpressie regelen
o SNP creëren
o Reporterfusies maken met behoud van endogene genregulatie
Basis principe van genoom editing door endonucleases
• Endonucleases creëren DSBs (double strand breaks) in het genoom
• Ze worden naar een specifieke plaats in het genoom geleid door een fusie met een DNA-
bindend eiwit of door een complementaire RNA molecule
(vroegere technieken: eiwit, bij CRISPR/Cas9: complementaire RNA molecule)
• DSBs worden dan gerepareerd door de endogene cellulaire DNA schade herstelmechanismen
• Non-Homologous End Joining (NHEJ) maakt fouten die leiden tot indels (= insertie/deletie)
• Wanneer een exogeen homoloog DNA template wordt geleverd, kan Homology Directed
Repair (HDR) het beschadigde DNA vervangen en zo elke gewenste specifieke mutatie
invoegen
Twee belangrijke repair pathways van DSBs
• NHEJ → Knock-outs creëren
o Meer foutgevoeliger (error prone)
o Creëert indels
o Gebruikt geen template
o Komt met hogere frequentie voor
• HDR → Knock-ins, fusies, etc creëren
o heeft een homoloog template
(donor) nodig
o inefficiënt, maar nauwkeuriger
3
